建立原位和自发PDAC小鼠模型
模拟PDAC原发肿瘤和转移的体内环境，评估EC-FAK缺失对肿瘤生长和转移的影响
将8661或TB32048细胞原位注射至Pdgfb-iCreERT;Fakfl/fl小鼠胰腺，或使用KPF自发模型，并通过他莫昔芬诱导EC-FAK缺失。
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抑制内皮细胞FAK表达减少吉西他滨治疗后的胰腺导管腺癌转移
Suppression of Endothelial Cell FAK Expression Reduces Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Metastasis after Gemcitabine Treatment
实验完整度
高包含多个独立证据层级：原位和自发小鼠模型、细胞系实验、磷酸化蛋白质组学、患者样本分析，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
8661小鼠胰腺癌细胞原位移植模型 TB32048小鼠胰腺癌细胞原位移植模型 KPF自发胰腺癌小鼠模型 小鼠原代肺内皮细胞 人胰腺癌患者样本
重点核对
EC-FAK敲除诱导方案：他莫昔芬处理（10 mg/mL，100 μL，腹腔注射，连续两天） 吉西他滨治疗方案：75 mg/kg，腹腔注射，隔天一次，共三次 细胞系：8661和TB32048 转染或注射细胞数：原位注射1×10^3，脾内注射4×10^5 统计方法：Kaplan-Meier生存分析，Gehan-Breslow-Wilcoxon检验
摘要
尽管实体癌治疗取得了重大进展，但治疗耐药性仍然是延长无进展生存期的主要障碍。胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的癌症之一，具有高水平的肝转移。原发性PDAC高度缺氧，转移灶对一线治疗（包括吉西他滨）耐药。近期研究表明，内皮细胞（EC）局灶黏附激酶（FAK）调节DNA损伤治疗诱导的血管分泌因子和原发肿瘤模型中的化疗敏感性。在此，我们证明在PDAC的原位和自发小鼠模型中，诱导性缺失EC-FAK不足以影响原发肿瘤生长，但可减少肝和肺转移负荷，并提高吉西他滨治疗（而非未治疗）小鼠的生存率。EC-FAK缺失不影响原发肿瘤血管生成、肿瘤血管渗漏或转移早期事件，包括循环肿瘤细胞数量、肿瘤细胞归巢或转移种植。磷酸化蛋白质组学分析显示，与吉西他滨处理的野生型EC相比，吉西他滨处理的FAK缺失EC中MAPK、RAF和PAK信号通路下调。此外，低水平的EC-FAK与吉西他滨治疗的PDAC患者生存期延长和复发减少相关，支持这些发现的临床相关性。总之，我们确定了EC-FAK在吉西他滨治疗后调节PDAC转移的新作用，该作用影响患者结局。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 内皮细胞FAK是否在吉西他滨治疗条件下调节胰腺导管腺癌的转移？
- 核心机制
- EC-FAK缺失联合吉西他滨处理通过下调MAPK、RAF和PAK信号通路，减少内皮细胞分泌的促肿瘤增殖的血管分泌因子，从而抑制转移灶的生长。
- 主要证据
- 在原位和自发小鼠模型中，EC-FAK缺失减少吉西他滨治疗小鼠的肝肺转移面积并提高生存率；磷酸化蛋白质组学显示MAPK/RAF/PAK通路下调；条件培养基实验显示FAK缺失EC的条件培养基减少肿瘤细胞增殖。
- 研究意义
- 提示联合靶向EC-FAK和吉西他滨可能成为控制PDAC转移的潜在临床策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
吉西他滨或生理盐水处理
比较EC-FAK缺失在化疗条件下对肿瘤生长和转移的影响
对荷瘤小鼠进行吉西他滨（75 mg/kg）或生理盐水腹腔注射，隔天一次，共三次。
评估原发肿瘤生长和转移负担
测定EC-FAK缺失对原发肿瘤生长、转移结节数量和大小的影响
通过MRI监测肿瘤生长，终点测量肿瘤体积和重量；通过H&E染色评估肝和肺转移结节数量和面积。
评估血管功能和吉西他滨递送
排除EC-FAK缺失通过影响血管密度、渗漏或药物递送来改变转移的可能性
通过免疫组化检测内皮黏蛋白评估血管密度；通过Hoechst染料渗漏评估血管通透性；通过LC-MS/MS检测吉西他滨及其代谢物在肿瘤和肝脏中的含量。
检测循环肿瘤细胞、归巢和种植
确定EC-FAK缺失是否影响转移的早期步骤
通过流式细胞术检测血液中CD45-Pdx1+细胞（CTC）；通过脾内注射GFP标记的肿瘤细胞检测2小时归巢；通过Pdx1染色检测48小时种植和7天克隆。
磷酸化蛋白质组学分析
鉴定EC-FAK缺失在吉西他滨处理下影响转移的信号通路
对FAK野生型和敲除的内皮细胞在不同氧条件下（常氧/低氧）和吉西他滨处理下进行磷酸化蛋白质组学分析，并验证PAK1和β-catenin磷酸化水平。
条件培养基实验验证血管分泌功能
验证EC-FAK缺失通过改变血管分泌因子影响肿瘤细胞增殖
用吉西他滨处理FAKWT和FAKKO内皮细胞，收集条件培养基，添加到8661肿瘤细胞中，通过MTT实验检测增殖。
临床样本分析
评估EC-FAK表达水平与吉西他滨治疗患者预后之间的相关性
对人PDAC肿瘤组织切片进行CD34和FAK免疫荧光共染，计算FAK阴性血管百分比，并与生存率和复发率关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 吉西他滨 | Gemzar | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | D6429 |
| 胎牛血清 | Sigma | F9665 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P4333 | |
| 免疫染色 | 抗FAK抗体 | Cell Signaling Technology | 3285 |
| 抗磷酸化PAK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 2601 | |
| 抗PAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2602 | |
| 抗磷酸化β-连环蛋白(Ser675)抗体 | Cell Signaling Technology | 4176 | |
| 抗HSC70抗体 | Santa Cruz Biotechnology | V7C7 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 | |
| 流式细胞术 | 抗Pdx-1抗体 | Abcam | ab47383 |
| CD45-Pacific Blue偶联抗体 | BioLegend | 103125 | |
| 抗山羊Alexa Fluor 647二抗 | Invitrogen | -- | |
| Zombie Green可固定活力检测试剂盒 | BioLegend | -- | |
| 细胞标记 | CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
| 组织消化 | 胶原酶P | Roche | 11213865001 |
| 裂解液 | ACK裂解液 | Gibco | A10492-01 |
| 染色 | Hoechst染料 | Thermo Fisher Scientific | 33342 |
| 免疫染色 | 抗CD31抗体 | BioLegend | 102498 |
| 抗内膜黏蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc65495 | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | 16667 | |
| 抗Glut-1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 37783 | |
| 抗裂解caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| 抗PECAM抗体 | Agilent Dako | 76539 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 5741 | |
| 抗CD34抗体 | ZSGB-BIO | ZM-0046 | |
| 染色 | Vectashield抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| Vectastain ABC试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| Vectastain ABC HRP Elite试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| 抗原修复液，柠檬酸基 | Vector Laboratories | H-3300 | |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector Laboratories | SP2001 | |
| Dako洗涤缓冲液 | Dako | S3006 | |
| 抗体稀释液 | Invitrogen/Thermo Fisher Scientific | 003218 | |
| DPX封片剂 | Sigma | 06522-500ML | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Molecular Probes | -- | |
| 蛋白质定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质组学 | 胰酶珠（TLCK-胰酶） | Thermo Fisher Scientific | 20230 |
| OASIS-HLB固相萃取柱 | Waters | -- | |
| TiO2微珠 | Hichrom | -- | |
| 细胞增殖检测 | MTT粉末 | Invitrogen | M6494 |
| 仪器 | MRI系统（Bruker ICON 1T） | Bruker | -- |
| 超声系统（Vevo 2100） | VisualSonics | -- | |
| 流式细胞仪（BD LSRFortessa） | BD Biosciences | -- | |
| 切片扫描仪（NanoZoomer S210） | Hamamatsu | -- | |
| Pannoramic 250 Flash扫描仪 | 3D HISTECH | -- | |
| Q-Exactive plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| nano flow ultimate 3000 RSL纳升仪器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Omega酶标仪 | BMG Labtech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与基因型 | 小鼠品系：Pdgfb-iCreERT;Fakfl/fl（EC-FAKKO）和对照；KPF自发模型基因型；他莫昔芬诱导方案 阅读提示：见Materials and Methods中'Genetic modified mouse models'和'In vivo treatment strategy' |
| 细胞系与培养 | 细胞系8661和TB32048的来源及培养条件（DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素） 阅读提示：见Materials and Methods中'8661 and TB32048 pancreatic cancer cell lines'和'Cell culture' |
| 肿瘤接种 | 原位注射细胞数（1×10^3）和体积（10 μL Matrigel/PBS）；脾内注射细胞数（4×10^5）和体积（30 μL PBS） 阅读提示：见Materials and Methods中'Pancreatic orthotopic injections'和'Intrasplenic injections' |
| 药物处理 | 他莫昔芬剂量和给药方式（10 mg/mL，100 μL，腹腔注射，连续两天）；吉西他滨剂量（75 mg/kg）和给药方案（隔天一次，共三次） 阅读提示：见Materials and Methods中'In vivo treatment strategy' |
| 转移评估 | 转移结节计数和面积量化方法（H&E染色，使用Pannoramic Viewer软件） 阅读提示：见Materials and Methods中'Tumor progression and metastasis assessment' |
| 血管功能检测 | 血管密度（endomucin染色）、渗漏（Hoechst）和药物递送（LC-MS/MS）方法 阅读提示：见Materials and Methods中'Hoechst leakage'和'Gemcitabine delivery' |
| 转移早期事件检测 | CTC检测（CD45-Pdx1+）、归巢（2小时）和种植（48小时）和克隆（7天）实验方法 阅读提示：见Materials and Methods中'Circulating tumor cells'、'Homing experiment'和'Seeding and colonization experiment' |
| 磷酸化蛋白质组学 | 内皮细胞处理条件（60 nM吉西他滨，常氧或缺氧）、LC-MS/MS参数和数据检索方法 阅读提示：见Materials and Methods中'Phosphoproteomics analysis'和'Peptide identification and quantification' |
| 临床样本分析 | 患者样本处理、免疫荧光染色和FAK阴性血管定量方法 阅读提示：见Materials and Methods中'Immunostaining of human tissue'和Results'Low EC-FAK expression correlates with...' |