建立曲妥珠单抗耐药细胞模型
获得对曲妥珠单抗耐药的HER2阳性胃癌细胞株，用于后续机制研究。
使用3D胶原模型，将NCI-N87和SNU216细胞与10 µg/mL曲妥珠单抗共培养6个月，筛选出耐药细胞株，并通过细胞活力、克隆形成等验证耐药性。
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通过PER1-HK2轴破坏昼夜节律可逆转胃癌中的曲妥珠单抗耐药性
Disrupting Circadian Rhythm via the PER1-HK2 Axis Reverses Trastuzumab Resistance in Gastric Cancer
实验完整度
高涉及体外细胞模型（NCI-N87、SNU216及耐药株）、动物移植瘤模型和患者来源样本，包含基因沉默/过表达、ChIP、Co-IP、PET-CT及功能验证。
主要模型
NCI-N87及耐药株NCI-N87TR SNU216及耐药株SNU216TR BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
细胞同步化：地塞米松100 nmol/L处理2小时 PER1敲低：稳定转染GV248-PER1 shRNA 曲妥珠单抗浓度：体外10 µg/mL，体内10 mg/kg 二甲双胍浓度：体外10 mmol/L，体内250 mg/kg 给药时间：ZT6和ZT18
摘要
曲妥珠单抗是HER2阳性晚期胃癌一线治疗中唯一获批的靶向药物，但原发耐药率高和继发耐药出现快限制了其临床获益。我们发现曲妥珠单抗耐药（TR）胃癌细胞表现出高糖酵解活性，这种活性由己糖激酶2（HK2）依赖性糖酵解以昼夜节律模式控制（在授时时间（ZT）6时较高，ZT18时较低）。机制上，HK2昼夜节律振荡由PPARγ和核心时钟基因PER1组成的转录复合物调控。体内和体外实验表明，沉默PER1可破坏PER1-HK2的昼夜节律并逆转曲妥珠单抗耐药。此外，二甲双胍（可抑制糖酵解和PER1）在ZT6与曲妥珠单抗联合使用，显著提高了胃癌中曲妥珠单抗的疗效。总之，这些数据将昼夜节律引入曲妥珠单抗治疗，并提出了一种潜在有效的时辰治疗策略，以逆转胃癌中的曲妥珠单抗耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中糖酵解是否呈现昼夜节律，以及时钟基因PER1是否通过调控HK2参与耐药，并据此提出时辰治疗策略。
- 核心机制
- PER1与PPARγ相互作用形成复合物，增强PPARγ对HK2启动子的转录活性，从而驱动HK2依赖性糖酵解的昼夜节律，导致曲妥珠单抗耐药。
- 主要证据
- TR细胞中HK2表达和糖酵解水平呈昼夜节律；CHIP-qPCR显示PPARγ结合HK2启动子；Co-IP证实PER1-PPARγ互作；PER1敲低降低HK2表达并恢复曲妥珠单抗敏感性；二甲双胍在ZT6联合曲妥珠单抗显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 将昼夜节律引入曲妥珠单抗治疗，提出基于糖酵解节律的时辰治疗策略，为克服胃癌曲妥珠单抗耐药提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测耐药细胞的糖酵解昼夜节律
探究耐药细胞中糖酵解是否存在昼夜节律及其特征。
用地塞米松同步化细胞，在不同ZT点检测糖酵解相关基因表达、HK酶活性、ATP和乳酸水平，并通过18F-FDG PET-CT检测体内肿瘤糖酵解水平。
鉴定调控HK2的核心时钟基因
筛选调控HK2表达和昼夜节律的时钟基因。
通过RNA干扰沉默11个核心时钟基因，检测HK2表达变化，并进一步验证BMAL1、CLOCK和PER1的作用。
验证PER1通过PPARγ调控HK2的机制
阐明PER1调控HK2的分子机制。
通过免疫荧光和Co-IP验证PER1与PPARγ的相互作用，通过ChIP-qPCR验证PPARγ直接结合HK2启动子，并通过siRNA和激动剂实验验证PPARγ在PER1调控HK2中的作用。
验证PER1对曲妥珠单抗耐药的影响
确定PER1在体内外是否影响曲妥珠单抗耐药。
在PER1敲低的TR细胞中，体外检测细胞活力和凋亡，体内皮下移植瘤模型给予曲妥珠单抗，观察肿瘤生长、增殖和凋亡指标。
评估二甲双胍时辰治疗策略
验证基于昼夜节律的二甲双胍联合曲妥珠单抗能否逆转耐药。
在TR移植瘤模型中，于ZT6和ZT18给予二甲双胍和/或曲妥珠单抗，比较不同时间点的抗肿瘤效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Solarbio | 31800 |
| 胎牛血清 | Wisent | -- | |
| 耐药细胞建立 | 曲妥珠单抗 | Roche | -- |
| 胶原蛋白 | Gibco | 2052954 | |
| 昼夜节律诱导 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 |
| Western blot | 抗HK2抗体 | Proteintech | 22029-1-AP |
| 抗PER1抗体 | Boiss | bs-2350R | |
| Co-IP | 抗FLAG抗体 | CST | 8146 |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | 9003 |
| PET-CT | 18F-氟代脱氧葡萄糖 | -- | -- |
| 药物处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | MCE | HY-13966 |
| 罗格列酮 | MCE | HY-17386 | |
| 吡格列酮 | MCE | HY-13956 | |
| 糖酵解检测 | 己糖激酶试剂盒 | Cominbio | HK-1-Y |
| 乳酸检测试剂盒 | Jiancheng Bioengineering Institute | A019-2-1 | |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 | |
| 细胞活力检测 | Calcein-AM/PI试剂盒 | BestBio | BB-4126-2 |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂盒 | Vazyme | R401-01 |
| 第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | R312-01 | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白浓度测定 | BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0011 |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂盒 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与耐药模型建立 | 细胞系来源、3D胶原模型具体构建参数（胶原浓度、细胞数）、曲妥珠单抗浓度和处理时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines |
| 昼夜节律同步化 | 地塞米松浓度、处理时间、ZT0定义、取样时间点 阅读提示：Materials and Methods: Circadian rhythm induction |
| PER1敲低 | shRNA序列、转染条件、筛选浓度（嘌呤霉素）、敲低效率验证 阅读提示：Materials and Methods: DNA constructs and siRNA transfection |
| 体内药效实验 | 动物品系、周龄、细胞注射数量、给药剂量、给药频率、给药时间点、肿瘤测量方式 阅读提示：Materials and Methods: Animal studies |
| 二甲双胍时辰治疗 | 二甲双胍剂量、给药时间（ZT6和ZT18）、联合用药方案 阅读提示：Results: 最后一个部分；Materials and Methods: Animal studies (experiment 4) |