验证DAU对MYC过表达细胞的选择性毒性
确定CTPS抑制剂DAU是否优先抑制MYC过表达细胞的活力。
在四环素诱导的ARPE-19-MYC细胞及RKO、SW480、HCT116细胞（含对照和MYC敲低）中用CCK-8检测细胞活力，并用流式细胞术分析细胞周期。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CTPS1与ATR的联合失活对MYC过表达癌细胞具有合成致死性
Combined Inactivation of CTPS1 and ATR Is Synthetically Lethal to MYC-Overexpressing Cancer Cells
实验完整度
高包含细胞系模型（ARPE-19、HCT116等）的体外实验、3D培养、异种移植瘤模型及TCGA数据分析，并通过shRNA/CRISPR敲除、回复实验、抑制剂联合等进行功能与机制验证。
主要模型
ARPE-19-MYC诱导表达细胞系 HCT116、RKO、SW480、Raji等癌细胞系 HCT116异种移植瘤模型（裸鼠）
重点核对
MYC过表达依赖性：在ARPE-19-MYC（DOX+）与DOX−细胞、MYC敲低细胞中验证DAU选择性杀伤。 CTPS1 vs CTPS2的差异性：通过shRNA敲低和CRISPR敲除HCT116、RKO中的CTPS1或CTPS2，观察BAY-1895344诱导的凋亡和p-Chk1水平。 DAU和ATR抑制剂联合：在SW480、HCT116、RKO等细胞中，联合处理诱导H2AX磷酸化和凋亡，MYC敲低可逆转。 体内验证：HCT116异种移植瘤模型中，DAU（75 mg/kg）和BAY-1895344（10 mg/kg）联合给药显著抑制肿瘤生长。
摘要
“不可成药”的癌基因MYC通过平行诱导多种合成代谢过程来支持癌细胞的增殖和存活。在这里，我们发现抑制CTP合酶（CTPS）能选择性地降低MYC过表达细胞的活力并诱导DNA复制应激。MYC驱动的rRNA合成导致了CTPS抑制时的选择性DNA复制应激。CTPS与共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白（ATR）的联合抑制在MYC过表达细胞中具有合成致死性，在体外促进细胞死亡，在体内减少肿瘤生长。出乎意料的是，干扰CTPS1而非CTPS2是诱导MYC失调癌细胞中复制应激以及在存在ATR抑制剂时随后细胞死亡所必需的。这些结果凸显了CTPS1在MYC驱动的癌症中的特定关键作用，表明选择性抑制CTPS1与ATR联合可能是对抗疾病进展的有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑制CTPS是否对MYC过表达癌细胞构成选择性脆弱性，以及联合抑制CTPS和ATR是否能诱导合成致死？
- 核心机制
- MYC驱动的rRNA合成增加对CTP的需求，抑制CTPS1导致嘧啶合成受阻，造成合成代谢失衡，引发DNA复制应激；联合ATR抑制剂时，复制应激转化为DNA损伤和凋亡，实现合成致死。
- 主要证据
- 体外实验表明DAU选择性抑制MYC过表达细胞活力并诱导复制应激（p-Chk1、p-ATR），外源胞苷/尿苷可逆转；联合ATR抑制剂诱导H2AX磷酸化和凋亡；体内异种移植瘤模型证实联合治疗显著抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 本研究提出一种靶向MYC驱动癌症的新策略，即通过抑制CTPS1维持核糖体合成活性，造成合成代谢失衡，联合ATR抑制剂选择性杀死癌细胞；鉴于CTPS1缺乏在人类中除免疫缺陷外无明显临床后果，开发CTPS1特异性抑制剂具有临床意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测DAU诱导的复制应激
阐明DAU处理是否在MYC过表达细胞中诱导DNA复制应激，并验证其依赖于MYC驱动的rRNA合成。
通过免疫印迹检测Chk1 Ser345和ATR Thr1989磷酸化；用核苷（胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷）或RNA Pol I抑制剂（CX-5461、BMH-21、CX-3543）处理，观察对复制应激的影响。
验证DAU与ATR抑制剂联合诱导DNA损伤
确定DAU与ATR抑制剂联合是否在MYC过表达细胞中诱导DNA损伤，并依赖于MYC。
用DAU和ATR抑制剂（BAY-1895344、VE-822、AZD6738）单用或联用处理细胞，通过免疫印迹检测γH2AX，免疫染色和彗星实验评估DNA损伤。
评估联合处理的合成致死效应
确定DAU和ATR抑制剂联合能否在MYC过表达细胞中选择性诱导凋亡和细胞死亡。
使用Annexin V/PI染色流式细胞术检测凋亡；用pan-caspase抑制剂Q-VD-Oph验证凋亡机制；通过克隆形成评估长期增殖抑制；用shRNA敲低ATR或MYC验证依赖性。
体内和三维培养验证
评估联合治疗在更接近生理条件下的抗肿瘤效果。
在Matrigel三维培养中评估HCT116、RKO和ARPE-19-MYC球体生长；在裸鼠HCT116异种移植瘤模型中，单独或联合给予DAU和BAY-1895344，测量肿瘤体积和重量。
鉴定CTPS1是关键靶点
区分CTPS1和CTPS2在MYC过表达细胞中对复制应激和凋亡的贡献。
通过shRNA敲低和CRISPR/Cas9敲除HCT116和RKO中的CTPS1、CTPS2，单独或同时敲除，用BAY-1895344处理，流式检测凋亡，免疫印迹检测p-Chk1；通过回复实验表达Flag-CTPS1或CTPS2验证特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 3-氮杂尿苷 | Santa Cruz | sc-394445 |
| BAY-1895344 | MedchemExpress | HY-101566A | |
| VE-822 | Selleck Chemicals | S7102 | |
| AZD6738 | Selleck Chemicals | S7693 | |
| 羟基脲 | Selleck Chemicals | S1896 | |
| 胞苷 | Selleck Chemicals | S2053 | |
| 尿苷 | Selleck Chemicals | S2029 | |
| 鸟苷 | Selleck Chemicals | S2439 | |
| 腺苷 | Selleck Chemicals | S1647 | |
| 多西环素 | Selleck Chemicals | S5159 | |
| VX-680 | Selleck Chemicals | S1048 | |
| Purvalanol A | Selleck Chemicals | S7793 | |
| BMH-21 | APExBIO | B4896 | |
| CX-3543 | MedchemExpress | HY-14776 | |
| CX-5461 | MedchemExpress | HY-13323 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | SH30022.01 |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | SH30809.01 | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | 04-001 | |
| Matrigel基质胶 | Corning | -- | |
| GMyc-PCR支原体检测试剂盒 | Yeasen | #40601 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V | Biolegend | 640918 |
| 碘化丙啶 | Beyotime | ST511 | |
| Q-VD-Oph | -- | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sigma | V5265-500 mL |
| 彗星实验 | 彗星实验试剂盒 | Enzo | ADI-900-166 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | APExBIO | K1018 |
| RNA提取和qRT-PCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | -- | -- |
| 质粒构建 | pPLK/GFP + Puro载体 | Public Protein/Plasmid Library | -- |
| pPLK/mCherry + Puro载体 | -- | -- | |
| CRISPR/Cas9敲除 | pU6-(BbsI)_CBh-Cas9-T2A-mCherry载体 | Addgene | #64324 |
| 免疫印迹 | 抗Chk1抗体 | ProteinTech | 25887-1-AP |
| 抗H2AX抗体 | ProteinTech | 10856-1-AP | |
| 抗P53抗体 | ProteinTech | 10442-1-AP | |
| 抗ATR抗体 | ProteinTech | 19787-1-AP | |
| 抗CTPS1抗体 | ProteinTech | 15914-1-AP | |
| 抗MYC抗体 | Abcam | ab32072 | |
| 抗CTPS2抗体 | Abcam | ab196016 | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab6276 | |
| 抗磷酸化Chk1 (Ser345)抗体 | Cell Signaling Technology | #2348 | |
| 抗磷酸化组蛋白H2AX (Ser139)抗体 | Cell Signaling Technology | #9718 | |
| 抗磷酸化ATR (Thr1989)抗体 | Cell Signaling Technology | #58014 | |
| 抗切割型caspase-3 (Asp175)抗体 | Cell Signaling Technology | #9661 | |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz | Sc-7392 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（ARPE-19, SW480, HCT116, 293T, RKO, Raji）及培养基（DMEM或RPMI 1640）与血清（10% FBS） 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture |
| 药物处理 | DAU浓度（如5 μmol/L, 20 μmol/L）和处理时间（24小时至7天）；ATR抑制剂（BAY-1895344 50 nmol/L, VE-822, AZD6738）浓度及处理时间 阅读提示：Materials and Methods - Reagents and antibodies; Results 相应图注 |
| 细胞活力检测 | 细胞接种数量（未明确）、处理时间、CCK-8试剂盒的使用 阅读提示：Materials and Methods - Cell viability and apoptosis assay |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V/PI染色步骤、处理时间（24或48小时）、Q-VD-Oph浓度 阅读提示：Materials and Methods - Cell viability and apoptosis assay; Results 图4 |
| Western blot | 抗体稀释度（未明确）、蛋白上样量（未明确）、细胞处理时间和剂量（如DAU 5 μmol/L 24h） 阅读提示：Materials and Methods - Immunostaining and immunoblotting |