评估ceritinib单药活性
验证在具有ALK改变的HGSOC PDX模型中，ceritinib单药是否具有抗肿瘤活性。
利用具有ALK扩增、重排、突变或高表达的HGSOC PDX模型，给予ceritinib (100 mg/kg) 或对照治疗，监测肿瘤生长。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
重新定位色瑞替尼诱导DNA损伤并增强高级别浆液性卵巢癌中PARP抑制剂的应答
Repurposing Ceritinib Induces DNA Damage and Enhances PARP Inhibitor Responses in High-Grade Serous Ovarian Carcinoma
实验完整度
高包含体外细胞实验（克隆形成、Seahorse、ROS检测）、功能验证（siRNA敲低）、机制验证（复合体I活性、DNA损伤标志物）以及体内PDX模型验证。
主要模型
OVCAR-8和COV362卵巢癌细胞系 HGSOC患者来源异种移植(PDX)小鼠模型 PC3前列腺癌细胞系 MDA-MB-231乳腺癌细胞系
重点核对
细胞系：OVCAR-8、COV362、PC3、MDA-MB-231 处理药物及浓度：ceritinib (1.5 μmol/L)、olaparib、veliparib、IACS-010759等 PDX模型：PH345、PH038、PH039、PH115、PH048，及其HRD状态 体内给药方案：ceritinib 100 mg/kg、olaparib 50 mg/kg，每日口服灌胃，最长9周 检测终点：OCR、ROS水平、8-oxo-dG、γH2AX、PARP trapping、肿瘤面积
摘要
PARP抑制剂（PARPi）在同源重组（HR）修复缺陷的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中具有活性。然而，即使有应答的肿瘤也会产生PARPi耐药性，这凸显了延迟或阻止PARPi耐药性出现的必要性。在此，我们证明ALK激酶抑制剂色瑞替尼通过抑制线粒体电子传递链复合体I，增加活性氧（ROS）的产生，并随后诱导依赖PARP修复的氧化性DNA损伤，从而与PARPi产生协同作用。此外，色瑞替尼与PARPi联合治疗在HGSOC细胞系中无论HR状态如何均具有协同作用，并且色瑞替尼与PARPi奥拉帕尼联合使用在HGSOC患者来源异种移植（PDX）模型中比单独使用奥拉帕尼更有效地诱导肿瘤消退。值得注意的是，色瑞替尼与奥拉帕尼的联合在预先存在PARPi敏感性的PDX模型中效果最佳，且耐受性良好。这些发现揭示了抑制线粒体呼吸、积累ROS以及随后诱导DNA损伤是色瑞替尼的新作用。它们还表明，色瑞替尼与PARPi联合作为增强HGSOC中PARPi活性的手段值得进一步研究，特别是在既有HR缺陷的肿瘤中。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨色瑞替尼能否增强PARP抑制剂在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中的抗肿瘤活性及其潜在机制。
- 核心机制
- 色瑞替尼通过抑制线粒体电子传递链复合体I，导致ROS产生增加，进而诱导氧化性DNA损伤，该损伤依赖于PARP介导的碱基切除修复（BER）途径修复；PARP抑制剂阻断该修复过程，从而协同杀伤肿瘤细胞。
- 主要证据
- 体外实验显示色瑞替尼与PARPi在多种HGSOC细胞系中协同作用，且不依赖HR状态；机制实验证实其抑制复合体I、增加ROS和8-oxo-dG；体内PDX模型证实联合治疗在PARPi敏感模型中诱导显著肿瘤消退，且耐受性良好。
- 研究意义
- 该研究为将色瑞替尼重新定位为PARP抑制剂增敏剂提供了临床前证据，提示该联合方案，特别是对于具有预先存在HR缺陷的肿瘤，可能作为增强PARPi活性并延迟或阻止耐药的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ceritinib与PARPi的体外协同作用
在HR-proficient和HR-deficient的卵巢癌细胞系中，检测ceritinib与PARPi（olaparib、veliparib）联合是否产生协同效应。
在OVCAR-8、COV362细胞系及RAD51C敲低的OVCAR-8细胞中进行克隆形成实验，计算联合指数。
探究协同作用的机制
明确ceritinib通过何种机制增强PARPi的细胞毒性。
通过一系列实验排除了HR抑制和已知激酶靶点抑制，发现ceritinib抑制线粒体呼吸链复合体I，增加ROS产生，诱导氧化性DNA损伤，并证实该损伤由PARP依赖的BER途径修复。
评估联合治疗在体内PDX模型中的疗效
在HGSOC PDX模型中，评估ceritinib联合olaparib的抗肿瘤效果和耐受性。
在多个具有不同HR状态的HGSOC PDX模型中，比较单独给药和联合给药的肿瘤消退情况，并检测肿瘤组织中的氧化性DNA损伤。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Millipore | -- | |
| MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-118 | |
| 药物处理 | 色瑞替尼 | Selleck Chemicals | -- |
| 奥拉帕尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 维利帕尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| IACS-010759 | Selleck Chemicals | -- | |
| Linsitinib | Selleck Chemicals | -- | |
| 顺铂 | Teva Pharmaceutical Industries | -- | |
| SL0101 | Millipore | -- | |
| siRNA转染 | siGENOME SMARTpool siRNA | Dharmacon/Horizon Discovery | -- |
| BTX ECM 830电穿孔仪 | -- | -- | |
| Seahorse分析 | Seahorse XFp细胞外流量分析仪 | Seahorse Bioscience, Agilent Technologies | -- |
| XF质膜通透剂 | Agilent Technologies | 102504 | |
| 复合体V活性检测 | ATP合酶活性微孔板检测试剂盒 | Abcam | ab109714 |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Abcam | ab83355 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Abcam | ab139476 |
| qRT-PCR | miRNeasy小提试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | 18080-044 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| PARP捕获实验 | 亚细胞蛋白分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 78840 |
| Western blotting | RAD51C抗体 | Novus Biologicals | NB100-177 |
| XRCC1抗体 | Epitomics | 3631-1 | |
| IRS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3407T | |
| 磷酸化IRS1 (Tyr612)抗体 | Thermo Fisher Scientific | 44-816G | |
| PARP1抗体 | Abcam | ab32138 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| HSP90抗体 | -- | H9010 | |
| 间接免疫荧光 | 8-oxo-dG抗体 | Trevigen | 4354-MC-050 |
| γH2AX抗体 | Millipore | 05-636 | |
| PARP抗体 | Trevigen | 4335-MC-100 | |
| Hoechst-33342 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Prolong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Zeiss LSM780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- | |
| PDX研究 | SCID beige小鼠 | ENVIGO | -- |
| 利妥昔单抗 | Genentech, Inc. | -- | |
| 数据分析 | CalcuSyn软件 | Biosoft | -- |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| SAS软件 | SAS Institute Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基（RPMI-1640）、血清（8% FBS）、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods, Cell lines, cell culture, and drugs |
| 体外药物处理与克隆形成实验 | 细胞接种密度（OVCAR-8: 300细胞/孔；COV362: 300细胞/孔；PC3: 750细胞/孔；MDA-MB-231: 700细胞/孔）、药物浓度、处理时间（8-10天） 阅读提示：Materials and Methods, Colony formation assays; Figure 1 legend |
| 线粒体功能检测 | 细胞接种密度（Seahorse实验：OVCAR-8 6000细胞/孔，COV362 4000细胞/孔）、ceritinib浓度（1.5 μmol/L）、处理时间（12小时） 阅读提示：Materials and Methods, Seahorse assay; Figure 2 legend |
| 活性氧与DNA损伤检测 | ceritinib处理浓度和时间（ROS：12-18小时；8-oxo-dG/γH2AX/PAR：48小时）、抗体稀释比例 阅读提示：Materials and Methods, ROS assay, Indirect immunofluorescence; Figures 3 and 4 legends |
| PDX体内药效实验 | PDX模型类型（PH345, PH038, PH039, PH115, PH048）、给药剂量（ceritinib 100 mg/kg, olaparib 50 mg/kg）、给药方式（每日口服灌胃）、治疗周期（最长9周）、肿瘤测量方法（超声） 阅读提示：Materials and Methods, PDX studies; Figure 5 legend |
| 统计分析 | 统计学方法（重复测量分析、线性混合效应模型）、多重比较校正 阅读提示：Materials and Methods, PDX studies (Statistical analysis); Supplementary Table S3 |