小鼠模型与辐照诱导胸腺淋巴瘤
建立不同基因型小鼠的辐射诱导胸腺淋巴瘤模型，并收集肿瘤及配对正常组织。
使用C57BL/6J、KrasLA1、p53+/−和Tie2Cre;p53FL/−小鼠，辐照组接受1.8 Gy x4 TBI，未辐照组作为对照。收集肿瘤和尾组织进行后续分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠模型中辐射诱导胸腺淋巴瘤的全外显子组测序鉴定Notch1激活是p53野生型淋巴瘤的驱动因素
Whole-Exome Sequencing of Radiation-Induced Thymic Lymphoma in Mouse Models Identifies Notch1 Activation as a Driver of p53 Wild-Type Lymphoma
实验完整度
高包含全外显子组测序、Sanger测序、Western blot、qRT-PCR等分子检测，并利用Rbpj-Venus报告小鼠、胸腺细胞移植和条件性基因敲除进行体内功能验证，以及γ-分泌酶抑制剂体外实验，多层级验证Notch1信号在淋巴瘤发生中的必要性。
主要模型
C57BL/6J小鼠（野生型） KrasLA1小鼠 p53+/−小鼠 Tie2Cre; p53FL/−小鼠（未辐照p53−/−）
重点核对
辐照方案：1.8 Gy TBI，每周1次，共4次 Notch1和Ikzf1突变状态 Notch1 5'端缺失（Type 1 deletion）检测 ICN蛋白表达水平 Rbpj表达及下游靶基因（Hes1, Dtx1, Myc）
摘要
辐射诱导胸腺淋巴瘤的小鼠模型被广泛用于研究辐射诱导血癌的发展，并深入了解人类T细胞淋巴母细胞白血病/淋巴瘤的生物学。在这里，我们旨在通过对有或没有辐照的小鼠的肿瘤和配对正常组织进行全外显子组测序，确定辐射诱导胸腺淋巴瘤发展的关键致癌驱动因素。与未辐照p53−/−小鼠的胸腺淋巴瘤相比，辐照野生型（WT）、p53+/−和KrasLA1小鼠的胸腺淋巴瘤并未观察到显著更高数量的非同义体细胞突变。然而，基于p53的突变状态，在控制Notch1信号通路的基因中出现了不同的重复突变模式。在p53 WT淋巴瘤中，Notch1信号的优先激活也在RNA和蛋白质水平上观察到。Notch1信号激活的报告小鼠显示，全身照射（TBI）富集了Notch1hi CD44+胸腺细胞，这些细胞在胸腺细胞移植后可以在体内传播。机制上，未成熟胸腺细胞中Notch1信号的遗传抑制阻止了p53 WT小鼠中辐射诱导胸腺淋巴瘤的形成。总之，这些结果表明激活的Notch1信号在p53 WT小鼠TBI后胸腺淋巴瘤的多步癌变中起关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 辐射诱导的胸腺淋巴瘤中，关键的致癌驱动因素是什么？
- 核心机制
- Notch1信号通路的激活（通过Notch1突变、Notch1 1型缺失或Ikzf1失活）是驱动p53野生型小鼠辐射诱导胸腺淋巴瘤形成的关键机制。
- 主要证据
- 全外显子组测序显示p53野生型淋巴瘤中高频Notch1和Ikzf1改变；Western blot显示ICN蛋白高表达；Rbpj-Venus报告小鼠显示肿瘤细胞多为Venus阳性；LckCre;RbpjFL/FL小鼠中Rbpj缺失显著抑制淋巴瘤发生。
- 研究意义
- 揭示Notch1信号是辐射诱导胸腺淋巴瘤的关键驱动因素，为理解辐射致血癌机制提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全外显子组测序及突变分析
识别胸腺淋巴瘤中的体细胞突变和拷贝数变异。
提取肿瘤和配对正常组织的DNA，进行全外显子组测序，分析非同义突变、突变特征、拷贝数变异，并鉴定COSMIC基因的改变。
Notch1信号通路改变的验证
验证测序发现的Notch1和Ikzf1突变及其对Notch1信号的影响。
通过Sanger测序和靶向测序验证突变，通过PCR检测Notch1 1型缺失，通过Western blot检测ICN蛋白表达，并通过qRT-PCR检测Notch1靶基因表达。
体外功能实验
确定ICN蛋白的生物学效应及Notch1信号在肿瘤细胞中的作用。
用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理p53 WT淋巴瘤细胞，检测ICN蛋白水平变化；测量Notch1靶基因表达。
体内功能和机制研究
确定Notch1信号激活的细胞类型及其在体内淋巴瘤发生中的作用。
利用Rbpj-Venus报告小鼠监测Notch1活性细胞；胸腺细胞移植实验评估供体细胞的扩增和CD44表达；LckCre;RbpjFL/FL小鼠特异性敲除Rbpj在未成熟胸腺细胞中的表达，观察对淋巴瘤发生的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 辐照 | X-RAD 320生物辐照仪 | Precision X-ray | -- |
| DNA提取 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| DNA/RNA提取 | AllPrep DNA/RNA迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| 外显子组捕获 | Agilent SureSelectXT小鼠全外显子试剂盒 | Agilent | S0276129 |
| RNA提取 | Direct-zol RNA迷你提取试剂盒 | Zymo Research | -- |
| DNA提取 | Quick-DNA迷你提取加试剂盒 | Zymo Research | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| qRT-PCR | TaqMan™通用PCR预混液 | Thermo Fisher | -- |
| PrimePCR SYBR Green检测 | Bio-Rad | -- | |
| SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白提取 | PARIS试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 蛋白定量 | Pierce快速金BCA蛋白检测 | Thermo Scientific | -- |
| Western blot | 0.2 μm硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- |
| Odyssey封闭缓冲液 | Li-Cor | -- | |
| ICN (Val1744)抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| 亲环蛋白A抗体 | Bio-Rad | VMA00535 | |
| IRDye 800CW和IRDye 680RD抗体 | Li-Cor | -- | |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 11058-021 |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875-093 | |
| 药物处理 | DAPT（γ-分泌酶抑制剂IX，LY-374973） | Selleckchem | S2215 |
| 流式细胞术 | FACSCanto流式细胞仪 | BD Pharmingen | -- |
| PE-Cy5偶联抗小鼠CD4抗体 | eBioscience | -- | |
| PE偶联抗小鼠CD8抗体 | eBioscience | -- | |
| APC偶联抗小鼠CD44抗体 | eBioscience | -- | |
| BV421偶联抗小鼠CD25抗体 | BioLegend | -- | |
| FITC偶联抗小鼠CD45.2抗体 | eBioscience | -- | |
| APC-eFluor780偶联抗小鼠CD45.1抗体 | eBioscience | -- | |
| PCR | Phusion聚合酶 | New England Biolabs | -- |
| Sanger测序 | AccuPrime Taq DNA聚合酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与辐照 | 小鼠品系、辐照剂量（1.8 Gy x4）与频率 阅读提示：Materials and Methods - Mouse strains and induction of thymic lymphomas |
| 全外显子组测序 | 测序文库制备方法、外显子捕获试剂盒、突变判定标准（非synonymous定义） 阅读提示：Materials and Methods - Whole exome sequencing (WES) |
| Notch1信号验证 | Notch1突变位点（外显子27, 34）、Ikzf1突变、Type 1 deletion检测、ICN蛋白表达 阅读提示：Materials and Methods - Notch1 Exon 1 Deletion PCR, Immunoblotting; Results - Notch1 signaling is dysregulated... |
| 体外实验 | 细胞培养条件、DAPT浓度和处理时间 阅读提示：Materials and Methods - Mouse and human cell culture |
| 体内功能研究 | Rbpj-Venus报告小鼠的使用、胸腺细胞移植方案、LckCre;RbpjFL/FL小鼠的辐照和观察时间 阅读提示：Materials and Methods - Thymocyte transplantation, Flow cytometry; Results - Inhibition of Notch1 signaling... |