建立AR高表达的膀胱癌细胞模型
获得AR表达稳定且均一的细胞系，用于后续分子机制研究
对UMUC3细胞进行单细胞克隆，筛选AR高表达克隆UMUC3-c31，并在炭剥离血清条件下培养以增强AR表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
雄激素受体调控膀胱癌中CD44的表达
Androgen Receptor Regulates CD44 Expression in Bladder Cancer
实验完整度
高包含体外细胞模型、AR ChIP-seq、转录组分析、体内功能基因组筛选、CRISPR验证及患者样本分析，具有多层级验证。
主要模型
UMUC3-c31人膀胱癌细胞系 小鼠异种移植模型 膀胱癌患者组织样本 TCGA膀胱癌数据集
重点核对
UMUC3-c31细胞在无酚红培养基+炭剥离血清中培养24小时以上以去除内源性雄激素 R1881刺激浓度为10nM，处理24小时 体内实验中每组小鼠数量（如shRNA筛选：完整组9只，去势组7只） CRISPR文库包含121个ChIP峰gRNA、10个非靶向对照和10个CD44编码序列靶向gRNA 患者TMA免疫组化评估AR和CD44表达，评分0-3
摘要
雄激素受体（AR）在实验性和人类膀胱癌的发生发展中都很重要。然而，AR在膀胱癌生长和进展中的作用尚不明确，文献表明更晚期和更高级别的疾病与AR表达降低相关。为了确定这些关系背后的机制，我们通过AR ChIP-seq和互补的转录组学方法，在体外合成雄激素R1881刺激下，对表达AR的人类膀胱癌细胞进行了分析。采用由混合shRNA或混合ORF文库组成的体内功能基因组学方法，评估了97个再现雄激素刺激相关表达方向的基因。有趣的是，我们鉴定出CD44，即透明质酸的受体，一种在多种肿瘤类型中是进行性疾病有效生物标志物和驱动因素的分子，与雄激素刺激显著相关。基于CRISPR的雄激素反应元件（ARE）突变分析确定了一个新的沉默元件，导致CD44表达的直接转录抑制。在人类膀胱癌患者中，肿瘤AR和CD44 mRNA及蛋白表达呈负相关，提示存在临床相关的AR-CD44轴。总的来说，我们的工作描述了一种新机制，部分解释了AR与膀胱癌肿瘤进展之间的负相关关系，并提示AR和CD44的表达可能有助于原发性膀胱癌的预后判断和治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AR在膀胱癌中的表达与肿瘤进展呈负相关，本研究旨在探究AR是否直接调控CD44表达及其机制。
- 核心机制
- AR通过结合CD44相关的新型雄激素反应元件（ARE）沉默元件，直接转录抑制CD44表达。
- 主要证据
- AR ChIP-seq和转录组分析鉴定CD44为AR直接靶基因；CRISPR突变ARE后CD44表达变化；患者样本中AR与CD44表达呈负相关。
- 研究意义
- 揭示了AR-CD44轴，可能解释AR在膀胱癌中的保护作用，并提示AR和CD44表达可用于预后判断和治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组AR结合位点分析
鉴定AR在全基因组上的结合位点，了解AR调控网络
UMUC3-c31细胞经R1881或对照处理，进行AR ChIP-seq，鉴定AR结合峰及富集元件。
转录组分析
检测AR激活引起的基因表达变化，筛选候选靶基因
UMUC3-c31细胞经R1881或对照处理，提取RNA进行微阵列分析，鉴定差异表达基因。
体内功能基因组筛选
在动物模型中验证AR调控的候选基因的功能相关性
构建ORF和shRNA混合文库，转导UMUC3-c31细胞后皮下注射到完整或去势雄性小鼠，通过肿瘤生长和NGS分析筛选功能相关基因。
CD44候选ARE的CRISPR验证
验证CD44相关ARE是否介导AR对CD44转录的调控
设计CRISPR gRNA库靶向CD44潜在ARE，转导细胞，R1881处理后FACS分选CD44高低群体，NGS分析gRNA富集；随后用单gRNA克隆验证。
临床样本关联分析
检验AR与CD44表达在膀胱癌患者中的相关性
分析TCGA数据、新辅助化疗数据集及组织芯片免疫组化染色，评估AR和CD44表达关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 炭剥离血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | R1881 | Perkin Elmer | -- |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
| VICRYL缝线 | VWR | -- | |
| 自动缝合夹 | Braintree Scientific | -- | |
| 细胞增殖 | 阿尔玛蓝 | -- | -- |
| BioTek Synergy H1酶标仪 | BioTek | -- | |
| ChIP-seq | Diagenode Bioruptor超声波破碎仪 | Diagenode | -- |
| 蛋白A/G PLUS-琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 蛋白酶K | Qiagen | -- | |
| 核糖核酸酶A | Qiagen | -- | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 琼脂糖 | -- | -- | |
| 溴化乙锭 | -- | -- | |
| Bio-Rad Chemidoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 微阵列 | PrimeView人类基因表达芯片 | ThermoFisher Scientific | -- |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoScientific | -- |
| Tris-甘氨酸蛋白凝胶 | Invitrogen | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SuperSignal West Pico Plus化学发光底物 | Thermo Scientific | -- | |
| RT-qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| iTaq SYBR green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| QuantStudio6实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMax转染试剂 | -- | -- |
| ORF文库构建 | Qiagen Plasmid Plus Maxi质粒提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| shRNA筛选 | Gentra Puregene DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| CRISPR筛选 | CD44-PE抗体 | Biolegend | -- |
| FACS分选 | MoFlo XDP100流式细胞分选仪 | Beckman Coulter | -- |
| 测序 | HiSeq4000测序仪 | Illumina | -- |
| 免疫组化 | CD44抗体（克隆E7K2Y） | Cell Signaling Technology | 37259 |
| AR抗体（克隆D6F11） | Cell Signaling Technology | 5153 | |
| Western blot | AR抗体（D6F11） | Cell Signaling Technology | -- |
| β-肌动蛋白抗体（13E5） | Cell Signaling Technology | -- | |
| CD44抗体（156-3C11） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 兔源IgG二抗，HRP标记 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 鼠源IgG二抗，HRP标记 | Cell Signaling Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与激素剥夺 | UMUC3-c31细胞在无酚红培养基+10%炭剥离血清（CSS）中至少培养24小时；培养基需含丙酮酸钠，细胞在37°C、5%CO2下培养。 阅读提示：见Materials and Methods: Cell Lines |
| AR ChIP-seq | R1881处理浓度10nM，处理时间24小时；对照为乙醇；细胞固定用1%甲醛；染色质剪切使用Bioruptor；抗体为SC-816X。 阅读提示：见Materials and Methods: ChIP-Seq及Figure 1 |
| 转录组微阵列分析 | R1881处理10nM 24小时；RNA提取用RNeasy kit；微阵列平台为PrimeView Human Gene Expression Arrays；差异表达阈值为FDR<0.05。 阅读提示：见Materials and Methods: Microarray及Figure 2 |
| 体内功能基因组筛选 | 小鼠为8-10周龄雄性裸鼠；去势手术方法；ORF筛选每组小鼠数量（完整n=6，去势n=4）；shRNA筛选每组数量（完整n=9，去势n=7）；细胞注射量1x10^6；肿瘤测量及终点标准。 阅读提示：见Materials and Methods: Animals, Castration, shRNA Functional Genomic Screen及Figure 4 |
| CRISPR筛选 | gRNA文库组成（131 oligos：121 ChIP峰、10 NTC、10 CD44-CDS）；转导后96小时加puromycin；R1881处理10nM；FACS分选CD44low/high；测序平台HiSeq4000。 阅读提示：见Materials and Methods: CRISPR targeted screen of proposed AREs及Figure 5 |
| 临床样本分析 | TCGA数据集（Firehose Legacy）中AR和CD44 mRNA表达数据；新辅助化疗数据集（n=115）；TMA免疫组化染色，AR和CD44评分0-3。 阅读提示：见Materials and Methods: Immunohistochemistry及Figure 7 |