鉴定缺氧响应细胞系
筛选在缺氧条件下EGFR表达显著诱导的乳腺癌细胞系。
对31种乳腺癌细胞系在20%或1% O2条件下暴露24小时，通过RT-qPCR评估EGFR mRNA表达变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
缺氧通过DNA甲基化特异性及HIF依赖性方式调节EGFR表达和下游信号传导，从而改变对抗EGFR治疗的反应
Hypoxia Alters the Response to Anti-EGFR Therapy by Regulating EGFR Expression and Downstream Signaling in a DNA Methylation-Specific and HIF-Dependent Manner
实验完整度
高包含细胞系筛选、CRISPR基因敲除、ChIP、荧光素酶报告基因、甲基化分析、细胞功能实验及动物模型等多个独立证据层级，并有明确功能与机制验证。
主要模型
乳腺癌细胞系（MCF-7、BT-474、MDA-MB-231、SUM-159等） CRISPR HIF-1α敲除MCF-7亚克隆 BT-474原位移植瘤模型（NOD-SCID Gamma小鼠） TCGA乳腺癌患者数据队列
重点核对
细胞系暴露于1% O2或缺氧条件的时间（24小时、48小时等） EGFR HRE的甲基化状态（CpG甲基化） HIF-1α、HIF-2α或对照的CRISPR敲除 EGFR抑制剂（吉非替尼、厄洛替尼）的剂量及处理时间 EGF刺激浓度及持续时间（100 ng/mL，0-8小时等）
摘要
肿瘤内缺氧发生在90%的实体瘤中，并且与患者的不良预后相关。癌细胞通过激活转录因子缺氧诱导因子1（HIF-1）和HIF-2来响应缺氧微环境。在此，我们研究了31种不同乳腺癌细胞系在缺氧条件下暴露时的独特基因表达模式。表皮生长因子受体（EGFR）是ErbB（禽成红细胞增多症癌基因B）受体家族的成员，在细胞增殖、侵袭、转移和凋亡中发挥作用，在31种乳腺癌细胞系中的7种中，EGFR被缺氧诱导。我们鉴定了一个功能性的缺氧反应元件（HRE），该元件在HIF-1结合到EGFR基因内含子18时被激活，在EGFR被缺氧诱导的细胞系中。EGFR HRE的CpG甲基化阻止了缺氧条件下的诱导。EGFR的HRE在正常乳腺组织和一些乳腺癌细胞系中是甲基化的，并且可以通过DNA甲基转移酶抑制剂处理来逆转。缺氧条件下EGFR的诱导导致AKT、ERK和Rb磷酸化增加，以及细胞周期蛋白D1、A、B1、E2F水平升高，并以HIF-1α依赖性方式抑制p21，从而导致细胞增殖和迁移。EGFR表达的增加使细胞对EGFR抑制剂敏感。总的来说，我们的数据表明，患有缺氧性乳腺肿瘤且EGFR低甲基化状态的患者可能受益于目前临床上使用的EGFR抑制剂。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺氧如何差异性地调控乳腺癌细胞系中EGFR的表达，以及这种调控是否影响对EGFR抑制剂的反应。
- 核心机制
- 缺氧时，HIF-1α直接结合EGFR基因内含子18中的功能性缺氧反应元件（HRE），从而诱导EGFR表达；该HRE的CpG甲基化状态决定其是否可被诱导，低甲基化允许缺氧诱导，高甲基化则阻止诱导。
- 主要证据
- 在31种乳腺癌细胞系中发现其中7种在缺氧下EGFR表达上调；ChIP验证HIF-1α结合EGFR内含子18；荧光素酶报告基因证实HRE功能；甲基化分析显示HRE甲基化与EGFR诱导能力相关；去甲基化药物处理恢复诱导；HIF-1α敲除消除诱导及下游信号激活，并影响细胞增殖和迁移；缺氧细胞对EGFR抑制剂更敏感。
- 研究意义
- 研究提示，具有缺氧肿瘤和EGFR基因低甲基化状态的患者可能受益于目前在临床上使用的EGFR抑制剂，为患者分层提供了潜在生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HIF-1α依赖性
确定HIF-1α是否为EGFR在缺氧条件下诱导所必需。
使用CRISPR技术敲除MCF-7细胞中的HIF-1α或HIF-2α，然后在缺氧条件下检测EGFR mRNA和蛋白水平。
鉴定功能性HRE
确认EGFR基因内含子18中的HRE是否直接受HIF-1α调控。
利用ChIP检测HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β在EGFR内含子区域的结合；构建含野生型或突变型HRE的荧光素酶报告基因载体，转染细胞后检测缺氧诱导的荧光素酶活性。
分析HRE甲基化状态
探究不同细胞系中EGFR HRE的甲基化状态是否与缺氧诱导差异相关。
对10种乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞进行亚硫酸氢盐测序和甲基化特异性PCR（MS-HRM）分析，评估EGFR HRE区域的CpG甲基化水平。
恢复去甲基化后的EGFR诱导
验证去甲基化处理能否恢复EGFR在缺氧条件下的诱导。
用DNA甲基转移酶抑制剂（AZA或DAC）处理MDA-MB-231和SUM-159细胞，检测HRE甲基化状态、HIF-1α结合及缺氧诱导的EGFR表达。
评估细胞功能和药物敏感性
确定缺氧诱导的EGFR表达对细胞增殖、迁移及对EGFR抑制剂敏感性的影响。
在缺氧和EGF刺激下检测细胞周期相关蛋白表达、Ki-67阳性细胞比例、细胞活性、细胞迁移能力；并用不同浓度的EGFR抑制剂（吉非替尼、厄洛替尼）处理细胞，比较缺氧和常氧条件下的细胞活性。
体内模型验证
在体内模型中评估EGFR表达与缺氧的关联。
将BT-474细胞注射到NSG小鼠的乳腺脂肪垫中，形成原位肿瘤，通过免疫组化检测肿瘤组织中EGFR和HIF-1α的表达及定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | invivo 200缺氧工作站 | -- | -- |
| McCoy培养箱 | -- | -- | |
| Lionheart显微镜 | Biotek | -- | |
| RT-qPCR | Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- |
| iScript cDNA合成系统 | Bio-Rad | -- | |
| iTaq SYBR Green通用预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫印迹 | NP-40缓冲液 | -- | -- |
| Trans-blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| 增强化学发光底物 | Perkin Elmer | -- | |
| c300成像仪 | Azure Biosystems | -- | |
| 抗EGFR抗体 | Proteintech | 18986-1-AP | |
| 抗磷酸化EGFR Y1068抗体 | Sigma | SAB4300063 | |
| 抗HIF-1α抗体 | BD Biosciences | 610958 | |
| 抗磷酸化Erk T202/Y204抗体 | Cell Signaling | 9106S | |
| 抗Erk抗体 | Cell Signaling | 4695S | |
| 抗磷酸化Akt S473抗体 | Cell Signaling | 9271L | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling | 9272S | |
| 抗磷酸化Rb S780抗体 | Cell Signaling | 9307S | |
| 抗Rb抗体 | Cell Signaling | 9309S | |
| 抗细胞周期蛋白D1抗体 | Cell Signaling | 2922S | |
| 抗细胞周期蛋白A抗体 | Santa Cruz | Sc-271682 | |
| 抗细胞周期蛋白E抗体 | Cell Signaling | 4129S | |
| 抗细胞周期蛋白B1抗体 | Santa Cruz | Sc-245 | |
| 抗C-myc抗体 | Cell Signaling | 13987S | |
| 抗p21 Waf1/Clip1抗体 | Cell Signaling | 2947S | |
| β-肌动蛋白-辣根过氧化物酶 | Proteintech | HRP-60008 | |
| 抗小鼠二抗-HRP | Azure | AC2115 | |
| 抗兔二抗-HRP | Azure | AC2114 | |
| 动物实验 | NSG小鼠 | -- | -- |
| 缓释雌二醇颗粒 | -- | -- | |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫组织化学 | Vectastain® Elite® ABC HRP试剂盒 | Vector Laboratories | PK-7200 |
| DAB过氧化物酶（HRP）底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Cytation 5细胞成像多功能检测仪 | BioTek | -- | |
| 细胞活性检测 | 厄洛替尼 | Selleck Chemicals | -- |
| 吉非替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 台盼蓝 | Gibco | -- | |
| Countess II FL自动细胞计数器 | Thermo Fisher | -- | |
| AlamarBlue™细胞活性检测试剂 | ThermoFisher | -- | |
| 结晶紫 | Sigma Aldrich | -- | |
| 细胞周期分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| ChIP | Covaris超声破碎仪 | -- | -- |
| 鲑鱼精DNA/蛋白A琼脂糖浆 | Millipore | -- | |
| IgG抗体 | Santa Cruz | -- | |
| 抗HIF-2α抗体 | Novus Biologicals | -- | |
| 抗HIF-1β抗体 | Novus Biologicals | -- | |
| 荧光素酶报告基因 | pENTR定向TOPO克隆试剂盒 | Life Technologies | -- |
| Gateway LR克隆酶 | Thermofisher Scientific | -- | |
| PolyJet体外DNA转染试剂 | SignaGen Laboratories | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 甲基化分析 | EpiTect®亚硫酸氢盐试剂盒 | Qiagen | 59824 |
| MS-HRM | Ultramer® DNA寡核苷酸 | IDT | -- |
| Precision Melt Supermix预混液 | Bio-Rad | 172-5110 | |
| 细胞迁移 | 可溶性大鼠尾I型胶原蛋白 | Corning | -- |
| 数据处理 | FlowJo V10软件 | Tree Star Inc. | -- |
| 成像分析 | Gen5 3.05软件 | BioTek | -- |
| 数据分析 | MATLAB | -- | -- |
| 统计分析 | R软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与缺氧处理 | 细胞系来源与培养条件；缺氧工作站参数（1% O2, 5% CO2, 94% N2）；处理时间（如24小时、48小时） 阅读提示：Materials & Methods: Cell Culture |
| EGFR表达检测 | RT-qPCR使用的引物序列及参照基因（18s rRNA）；免疫印迹使用的一抗稀释比例及品牌（如Proteintech、Cell Signaling） 阅读提示：Materials & Methods: Reverse Transcription and qPCR, Immunoblot Assays |
| CRISPR基因敲除 | MCF-7亚克隆中靶向HIF-1α或HIF-2α的sgRNA序列；敲除效率验证 阅读提示：Materials & Methods: Cell Culture; Figure 2A-B |
| HRE功能验证 | EGFR HRE序列及突变；报告基因载体构建方法；转染后缺氧处理时间（24小时） 阅读提示：Materials & Methods: Luciferase Reporter Plasmid Constructs, Firefly Luminescence Assay; Figure 3D-E |
| 甲基化分析 | 亚硫酸氢盐处理DNA量；MSP引物；MS-HRM反应条件；甲基化百分比计算方法 阅读提示：Materials & Methods: Bisulfite Modification, MS-HRM PCR; Figure 4 |
| 去甲基化处理 | AZA和DAC的浓度（500 nM、250 nM）及处理时间（3天）；停药后的培养时间（6、8、10天）；检测时间点 阅读提示：Materials & Methods: Cell Culture; Figure 5 |
| EGFR抑制剂敏感性检测 | Erlotinib和Gefitinib的浓度梯度；处理时间（48小时）；细胞计数方法 阅读提示：Materials & Methods: Cell Viability Assay; Figure 6F-H |
| 细胞周期与增殖检测 | EGF浓度（100 ng/mL）及处理时间；PI染色步骤；Ki67阈值（8000） 阅读提示：Materials & Methods: Propidium Iodide Staining, Automated Analysis for Percentage of Cells Positive for Ki67; Figure 6C-D |
| 细胞迁移实验 | BT-474细胞数量（1×10^4）；胶原包被；EGF浓度（100 ng/mL）；成像时间（23小时）及间隔（5分钟）；数据分析模型（APRW） 阅读提示：Materials & Methods: Cell Migration; Figure 6I-K |
| 动物模型 | 小鼠品系（NSG）及周龄（5-7周）；注射细胞数量（2×10^6）；雌激素颗粒剂量（2 mg）及植入时间；肿瘤取材标准（0.5 mm直径） 阅读提示：Materials & Methods: Animal Studies |
| 患者数据分析 | TCGA数据版本及下载来源；缺氧评分计算方式；统计方法（Mann-Whitney U检验、Pearson相关） 阅读提示：Materials & Methods: Patient Data Analysis; Figure 1E |