细胞系筛查与表型分组
评估NSCLC细胞系对6-thio-dG的敏感性并分为敏感和耐药组。
对77种NSCLC细胞系进行细胞活力测定，计算IC50，以中位数1.55μM为阈值区分敏感和耐药。
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SLC43A3是端粒DNA损伤介质6-硫代-2'-脱氧鸟苷敏感性的生物标志物
SLC43A3 Is a Biomarker of Sensitivity to the Telomeric DNA Damage Mediator 6-Thio-2'-Deoxyguanosine
实验完整度
高包含细胞系筛选（77种NSCLC）、转录组分析（微阵列和RNA-seq）、siRNA敲低和过表达功能验证、获得性耐药模型、异种移植体内验证及患者来源细胞和PDX验证。
主要模型
非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系（NCI和HCC系列） H2087获得性耐药克隆 异种移植模型（无胸腺裸鼠） 患者来源的NSCLC细胞（HCC4150和HCC4087）
重点核对
NSCLC细胞系对6-thio-dG的IC50值（阈值1.55μM） SLC43A3 mRNA表达水平（ddPCR定量） siRNA敲低SLC43A3后对6-thio-dG敏感性的变化 H2087获得性耐药克隆的建立（3μM长期处理） 异种移植实验中6-thio-dG给药剂量和频率（3mg/kg，每周5次，持续2周）
摘要
细胞膜转运蛋白促进核碱基和核苷的通过，用于核苷酸合成和代谢，并且对抗癌药物治疗中核苷类似物的递送很重要。在这里，我们研究了细胞膜转运蛋白是否参与核苷类似物DNA损伤介质6-硫代-2'-脱氧鸟苷（6-thio-dG）的细胞摄取。非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系的大部分（77个中的73个）对6-thio-dG敏感；只有4个NSCLC系对6-thio-dG耐药。通过微阵列和RNA测序分析时，耐药的NSCLC细胞系聚集在一起，为可能对6-thio-dG无反应的患者提供了分子特征。溶质载体家族43成员A3（SLC43A3）——一种平衡型核碱基转运蛋白——的显著下调被确定为该分子耐药特征中的候选基因。SLC43A3 mRNA的高水平预测对6-thio-dG的敏感性，因此SLC43A3可能作为NSCLC患者对6-thio-dG敏感性的有前景的生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞膜转运蛋白是否参与6-thio-dG的细胞摄取，以及SLC43A3是否作为NSCLC对6-thio-dG敏感性的生物标志物。
- 核心机制
- SLC43A3表达的降低导致NSCLC对6-thio-dG耐药，而高水平SLC43A3预测敏感性。
- 主要证据
- 在77种NSCLC细胞系中，4种耐药细胞系显示SLC43A3显著下调；siRNA敲低SLC43A3使敏感细胞产生耐药，过表达则增加敏感性；获得性耐药模型和异种移植实验验证了相关性。
- 研究意义
- SLC43A3可作为NSCLC患者对6-thio-dG敏感性的预测生物标志物，用于未来临床试验的患者筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
鉴定敏感和耐药细胞系之间的差异表达基因。
使用微阵列和RNA-seq分析40种敏感和4种耐药细胞系的基因表达。
候选基因验证
验证SLC43A3在敏感和耐药细胞系中的表达差异。
通过ddPCR检测SLC43A3 mRNA水平，并分析其与IC50的相关性。
功能验证
确定SLC43A3表达水平对6-thio-dG敏感性的影响。
在敏感细胞HCC4017中敲低SLC43A3，在耐药细胞H1693中过表达SLC43A3，检测IC50和细胞存活。
获得性耐药模型建立
建立获得性耐药的体外模型并研究SLC43A3表达。
用6-thio-dG长期处理敏感细胞H2087，筛选耐药克隆，检测SLC43A3表达和耐药性。
体内异种移植验证
在体内验证SLC43A3表达与6-thio-dG敏感性的关联。
将H2087敏感和耐药克隆接种裸鼠，给予6-thio-dG治疗，测量肿瘤体积并检测SLC43A3和γ-H2AX表达。
患者样本验证
评估SLC43A3在患者来源样本中的表达及其与预后的关系。
检测患者来源细胞系HCC4150和HCC4087的SLC43A3表达和6-thio-dG敏感性，并在PDX肿瘤中验证IHC与mRNA的相关性；通过TCGA数据分析SLC43A3表达与生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞活力检测
基因表达分析
体内实验
临床数据分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM:199培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI-1640培养基 | Sigma | -- | |
| 宇宙小牛血清 | Hyclone | -- | |
| e-Myco支原体检测试剂盒 | Boca Scientific | -- | |
| Power-Plex 1.2试剂盒 | Promega | -- | |
| 药物处理 | 6-硫代-2'-脱氧鸟苷 | Metkinen Oy | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96 水溶性细胞增殖检测试剂 | Promega | -- |
| siRNA转染 | OptiMEM培养基 | Invitrogen | -- |
| RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 靶向SLC43A3的siRNA双链 | Santa Cruz Biotechnology | sc-96371 | |
| 慢病毒包装 | pLenti6/V5_GW/lacZ载体 | Invitrogen | -- |
| pMD2.G包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 慢病毒浓缩 | Lenti-X病毒浓缩液 | Takara | 631231 |
| RNA提取 | RNeasy Plus微型试剂盒 | Qiagen | 74134 |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 |
| ddPCR | 通用探针库探针#9 | -- | 04685075001 |
| Western blot | Pierce IP裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 87788 |
| 完全微型蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 11836153001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 兔多克隆抗SLC43A3抗体 | Atlas Antibodies | HPA030551 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Sigma | -- | |
| 免疫组织化学 | Dako Autostainer Link 48系统 | Dako | -- |
| EnVision FLEX显色系统 | Dako | -- | |
| 滨松Nanozoomer 2.0HT扫描仪 | Hamamatsu | -- | |
| γ-H2AX免疫荧光 | 磷酸化组蛋白H2AX抗体 | Cell Signaling | 9718 |
| Alexa Fluor 568标记的山羊抗兔二抗 | Invitrogen | A11011 | |
| 免疫荧光封片 | 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- |
| 微阵列 | Illumina Human WG-6 V3芯片 | Illumina | BD-101-0203, BD-101-0603 |
| Illumina TotalPrep试剂盒 | Ambion | -- | |
| 微阵列扫描 | Illumina Beadstation 500 BeadArray扫描仪 | Illumina | -- |
| RNA-seq | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系培养 | 细胞系来源、培养基（DMEM:199或RPMI-1640）、血清浓度、CO2浓度、氧浓度（患者来源细胞需低氧） 阅读提示：Materials and Methods中的Cell lines部分 |
| 药物制备 | 6-thio-dG溶剂（DMSO/水1:1）、浓度（10mM或1mM）、储存温度 阅读提示：Materials and Methods中的Drug preparation部分 |
| 细胞活力测定 | 细胞密度、药物浓度范围、处理时间、测定方法 阅读提示：Materials and Methods中的Cell viability assay部分 |
| siRNA敲低 | siRNA序列、浓度（70nM）、转染试剂、处理时间 阅读提示：Materials and Methods中的Transient siRNA experiments部分 |
| 基因过表达 | 表达载体、包装质粒、转染细胞系、转染试剂 阅读提示：Materials and Methods中的Transfection, lentivirus production and infection部分 |
| 基因表达检测 | RNA提取方法、cDNA合成、引物和探针序列、ddPCR条件 阅读提示：Materials and Methods中的Reverse transcriptase and droplet digital PCR (ddPCR)部分 |
| 蛋白检测 | 蛋白提取缓冲液、抗体稀释度、上样量 阅读提示：Materials and Methods中的Western blot and immunohistochemistry (IHC) analysis部分 |
| 获得性耐药模型 | 亲本细胞系（H2087）、药物浓度（3μM）、处理时间（>6个月）、停药时间（11周） 阅读提示：Results中的6-thio-dG drug response of human SCLC部分及Figure 3 |
| 体内异种移植 | 小鼠品系、年龄、接种细胞数、给药剂量（3mg/kg）、给药频率（每周5次）、给药周期（2周）、肿瘤测量方法 阅读提示：Materials and Methods中的Xenograft experiment部分 |
| 生存分析 | TCGA数据下载方式、SLC43A3表达分组（最高和最低20%）、统计方法 阅读提示：Materials and Methods中的SLC43A3 expression and Kaplan–Meier survival curves部分 |