体外验证BC10系统
验证CRISPR-Cas9编辑效率和BC10条形码的可记录性。
从PtenloxP/loxP; Trp53loxP/loxP小鼠提取MEFs，用携带Cre和BC10的慢病毒感染，培养至28天，检测编辑效率和荧光标记。
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通过体细胞传递可记录条形码的克隆谱系追踪揭示转移性前列腺癌的迁移历史
Clonal Lineage Tracing with Somatic Delivery of Recordable Barcodes Reveals Migration Histories of Metastatic Prostate Cancer
实验完整度
高包含体外MEF实验、体内小鼠模型（EvoCaP）及人类数据集再分析，并有功能验证（CRISPR编辑、体内转移）和机制验证（克隆进化、迁移路径推断）。
主要模型
Pten/Trp53双敲除小鼠模型（EvoCaP） 原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 人类前列腺癌转移数据集（Gundem et al. 2015）
重点核对
小鼠模型：PtenloxP/loxP; Trp53loxP/loxP; R26-Cas9-eGFP 病毒滴定：1x10^5或2x10^5 FFU 注射剂量：20 μL 监测时间：最长60周 分析样本：10只转移小鼠，5只LP、5只HP
摘要
原发肿瘤向转移部位扩散的模式仍然知之甚少。在这里，我们使用一种新型的基于注射的小鼠模型——EvoCaP（前列腺癌进化模型），该模型具有向骨、肝、肺和淋巴结的侵袭性转移能力，定义了前列腺癌（PCa）的转移播种模式。为了确定原发部位和转移部位之间的迁移历史，我们使用我们的EvoTraceR流程追踪含有可记录条形码的不同肿瘤克隆。我们检测到原发肿瘤在转移播种中广泛存在的瘤内异质性，少数克隆群体（CPs）引发了大部分迁移。转移至转移的播种并不常见，因为大多数细胞仍局限于组织内。我们模型中的迁移模式与人类PCa播种拓扑结构一致。我们的研究结果支持将转移性PCa视为一种全身性疾病，由侵袭性克隆波扩大其生态位驱动，很少克服原本将其限制在原发或转移部位的约束。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 前列腺癌原发肿瘤如何播种到转移部位，以及不同克隆群体的迁移历史和拓扑结构是什么？
- 核心机制
- Pten/Trp53缺失突变的克隆内在地具有转移倾向，早期多克隆播种，但迁移事件稀少，大多数细胞保持组织限制；少数优势克隆驱动转移扩散。
- 主要证据
- 利用EvoCaP小鼠模型和BC10条形码，通过EvoTraceR和MACHINA分析，发现原发肿瘤中存在多种克隆群体，多数转移源自原发肿瘤，转移间播种频率低（≤2.9%）。
- 研究意义
- 该模型和流程可用于解析癌症克隆进化，为理解转移性前列腺癌的系统性传播及潜在治疗干预提供平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立EvoCaP小鼠模型
在体内诱导前列腺癌并实现转移。
向12周龄小鼠左前前列腺注射携带Cre和BC10的慢病毒，敲除Pten和Trp53，激活Cas9-eGFP，并记录BC10编辑。
克隆谱系追踪与迁移推断
推断不同克隆群体的迁移历史和播种拓扑。
从原发肿瘤和转移灶中提取DNA，扩增BC10并进行测序，使用EvoTraceR分析ASV和系统发育，使用MACHINA推断迁移历史。
人类数据比较
验证小鼠模型中的迁移模式是否与人类前列腺癌一致。
使用MACHINA重新分析人类前列腺癌数据（Gundem et al. 2015）中的四个样本，比较播种拓扑频率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 载体构建 | AgeI | -- | -- |
| BamHI | -- | -- | |
| EcoRI | -- | -- | |
| BsmBI | New England BioLabs | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 慢病毒生产 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences, Inc | -- |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解缓冲液 | EMD Millipore | -- |
| cOmplete蛋白酶抑制剂（无EDTA） | Sigma-Aldrich | -- | |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Precision Plus Protein双色标准蛋白阶梯 | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PTEN抗体 | Sigma-Aldrich | 04-035 | |
| p53抗体 | Cell Signaling Technology | 32532S | |
| Cre抗体 | Cell Signaling Technology | 15036S | |
| GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 2956T | |
| Rb1抗体 | Abcam | ab181616 | |
| Smad4抗体 | Cell Signaling Technology | 46535 | |
| Actin抗体 | Sigma-Aldrich | A3854 | |
| 免疫组织化学 | PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9559S |
| GFP抗体 | Abcam | ab183735 | |
| Ki67抗体 | Abcam | 16667 | |
| 免疫荧光 | GFP抗体 | Thermo Fisher | A10262 |
| Ck8抗体 | Abcam | ab133273 | |
| α-SMA抗体 | Abcam | ab7817 | |
| DAPI | -- | -- | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | FACSAria II细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 成像 | EVOS FL自动成像系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| IVIS SpectrumCT成像系统 | -- | -- | |
| Nikon SMZ1500体视显微镜 | Nikon | -- | |
| 免疫荧光成像 | Zeiss AXIO Observer Z.1共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| DNA提取 | 蛋白酶K | -- | -- |
| PCR | Taq 2x预混液 | New England Biolabs | M0270L |
| Q5热启动高保真2x预混液 | New England BioLabs | M0494S | |
| PCR产物纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| 测序 | 双链DNA定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| Qubit 4荧光计 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫荧光 | CitriSolv脱蜡剂 | Fisher Scientific | -- |
| 抗原修复液 | Vector Laboratories | -- | |
| 细胞培养 | Normocin | Invivogen | -- |
| 动物实验 | 美洛昔康 | -- | -- |
| 布比卡因 | -- | -- | |
| 异氟烷 | -- | -- | |
| 生物发光成像 | D-荧光素 | -- | -- |
| 实验耗材 | DispoCut解剖板 | Simport Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EvoCaP模型建立 | 小鼠基因型：PtenloxP/loxP; Trp53loxP/loxP; R26-Cas9-eGFP；病毒剂量：1x10^5或2x10^5 FFU；注射体积：20 μL；注射部位：左前前列腺；注射时间：12周龄 阅读提示：Methods: EVOCAP ANIMAL INJECTIONS |
| 细胞培养与体外验证 | MEFs来源：PtenloxP/loxP; Trp53loxP/loxP胚胎；培养条件：DMEM+10%FBS+1x pen/strep；感染时间：8小时；分析时间点：第7、14、28天 阅读提示：Methods: CELL CULTURE EXPERIMENTS |
| 分析流程 | 测序平台：Illumina 2x250PE；最小测序深度：50,000 reads/sample；软件版本：EvoTraceR 1.0, MACHINA v1.2 阅读提示：Methods: DNA AMPLICON (BARCODE 10 — BC10) PREPARATION AND AMPLICON SEQUENCING; COMPUTATIONAL METHODS |