耐药细胞系建立
在体外模拟KRASG12C和EGFR抑制剂联合治疗下获得性耐药的产生过程。
将C106和RW7213细胞暴露于递增浓度的sotorasib（0.1至3 μmol/L）和固定浓度（50 μg/mL）的cetuximab中，培养至出现耐药亚系。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
结直肠癌对KRASG12C-EGFR抑制获得性耐药的分子特征
Molecular Characterization of Acquired Resistance to KRASG12C-EGFR Inhibition in Colorectal Cancer
实验完整度
高包含细胞系耐药模型、PDX模型、患者样本及ctDNA纵向分析等多个证据层级，并进行了功能验证（衰老表型）和机制验证（MAPK/mTOR通路）。
主要模型
C106结直肠癌细胞系（耐药模型） RW7213结直肠癌细胞系（KRASG12C扩增耐药模型） CLR113患者来源异种移植瘤模型 结直肠癌患者样本及ctDNA
重点核对
耐药细胞系的建立：C106和RW7213细胞在递增浓度sotorasib（0.1至3 μmol/L）和50 μg/mL cetuximab下培养4个月和2个月 患者样本：12例接受KRASG12C抑制剂（adagrasib或sotorasib）联合EGFR抑制剂（cetuximab或panitumumab）治疗的结直肠癌患者 治疗中止后的样本采集：患者12在停药8天后进行进展期肝转移活检 KRASG12C扩增检测：通过FISH（>10个KRAS信号）和ctDNA分析
摘要
随着KRASG12C和EGFR抑制剂的联合使用，KRAS正成为结直肠癌的可成药靶点。然而，继发性耐药限制了其疗效。利用细胞系、患者来源的异种移植瘤和患者样本，我们检测到了异质性的假定耐药改变模式，这些改变预计主要通过阻止药物对ERK信号通路的抑制而发生。对治疗期间患者血液样本的系列分析表明，除KRASG12C扩增外，大多数这些改变检测频率较低，而KRASG12C扩增作为一种复发性耐药机制，其水平随临床进展而上升。停药后，携带KRASG12C扩增的耐药细胞发生癌基因诱导的衰老，进展期患者循环DNA中该改变水平迅速下降。在这种新状态下，由于mTOR信号通路升高，重新用药无效。然而，我们的工作揭示了一个潜在的治疗脆弱性，即针对衰老反应的疗法可能克服获得性耐药。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌对KRASG12C和EGFR抑制剂联合治疗产生获得性耐药的遗传机制是什么，以及是否存在可以利用的治疗脆弱性？
- 核心机制
- KRASG12C扩增是主要的复发性耐药机制，导致停药后MAPK和mTOR信号通路持续激活，引发癌基因诱导的衰老。
- 主要证据
- 细胞系（RW7213）和PDX模型（CLR113）均显示KRASG12C扩增；患者ctDNA纵向分析显示KRASG12C扩增与临床进展同步，停药后水平下降；患者活检标本显示MAPK和mTOR通路激活及p16表达升高。
- 研究意义
- 研究表明，针对衰老反应的疗法（如mTOR抑制剂）可能克服由KRASG12C扩增驱动的获得性耐药，为治疗策略提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
耐药克隆的遗传特征分析
鉴定耐药细胞中出现的基因突变和拷贝数改变。
使用MSK-IMPACT靶向测序和单细胞DNA测序分析耐药亚系的基因突变和拷贝数变化；通过FISH验证KRAS扩增。
耐药机制的患者ctDNA分析
在患者中检测与耐药相关的新发基因改变及其动态变化。
收集12例接受联合治疗患者的血浆，提取ctDNA进行测序，分析耐药相关改变。
停药后耐药细胞表型分析
评估停药对携带KRASG12C扩增耐药细胞的影响。
将耐药细胞在无药物培养基中培养，检测细胞形态、衰老相关标志物、信号通路激活及SASP。
停药后的治疗敏感性评估
测试停药后重新用药或使用其他抑制剂对耐药细胞的影响。
对停药后的细胞重新使用cetuximab+sotorasib或trametinib，检测MAPK和mTOR通路抑制效果及凋亡诱导。
针对衰老状态的药物敏感性测试
探索利用衰老状态作为治疗靶点的可能性。
使用mTOR抑制剂AZD8055和BCL2抑制剂navitoclax处理停药后的耐药细胞，评估其对细胞增殖的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Lonza | -- |
| Iscove改良培养基 | Lonza | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 索托拉西布 | SelleckChem | -- |
| 西妥昔单抗 | Pharmacy at MSKCC | -- | |
| 曲美替尼 | SelleckChem | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Pierce | 89901 |
| 磷酸酶和蛋白酶抑制剂 | Thermo Scientific | 1861277, | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | 23224 | |
| LDS上样缓冲液 | Invitrogen | NP0008 | |
| 还原剂 | Invitrogen | NP0009 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher | NP0321BOX | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | 1620233 | |
| Immobilon Western化学发光底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 抗p16抗体 | Cell Signaling Technology | 80772 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 抗磷酸化MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9154 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 抗总ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗磷酸化S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9204 | |
| 抗磷酸化S6 (235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| 抗磷酸化S6 (240/244)抗体 | Cell Signaling Technology | 5364 | |
| 抗uPAR抗体 | Cell Signaling Technology | 12713 | |
| 抗磷酸化RSK抗体 | Cell Signaling Technology | 9944 | |
| 抗磷酸化4E-BP1 (65)抗体 | Cell Signaling Technology | 9451 | |
| 抗磷酸化4E-BP1 (37/42)抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗纽蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 13901S | |
| 抗细胞周期蛋白D1抗体 | Thermo Scientific | PA516777 | |
| 抗KRAS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗NRAS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗磷酸化338-CRAF抗体 | Millipore | -- | |
| RAS-GTP pulldown | RAS-GTP下拉试剂盒 | Thermo Scientific | 16117 |
| SASP检测 | 人细胞因子/趋化因子阵列48-Plex HD48 | Eve technologies | -- |
| 动物实验 | 索托拉西布 | -- | -- |
| 西妥昔单抗 | -- | -- | |
| FISH | KRAS/Cen12探针混合物 | MSKCC | -- |
| 蔡司Axioplan 2i荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| CCD相机 | JAI | CV-M4+CL | |
| Isis 5.5.9成像软件 | MetaSystems Group Inc. | -- | |
| 免疫荧光染色 | Nunc Lab-Tek II腔室玻片系统 | Thermo Fisher | 154526 |
| ImaGeneRed C12RG | -- | I-2906 | |
| Ki-67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P10144 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Fiji软件 | -- | -- | |
| ctDNA分析 | Guardant360 CDx | Guardant Health | -- |
| ctDx FIRST | Resolution Bioscience | -- | |
| MSK-ACCESS检测 | MSK | -- | |
| DNA测序 | MSK-IMPACT二代测序检测 | MSK | -- |
| 单细胞DNA测序 | Tapestri平台 | Mission Bio | -- |
| SPRI磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| 生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| NextSeq 550测序仪 | Illumina, Inc. | -- | |
| Countess自动细胞计数器 | Invitrogen | -- | |
| 免疫组织化学 | 徕卡Bond RX | Leica | -- |
| EDTA抗原修复液ER2 | Leica | AR9640 | |
| Polymer Refine检测试剂盒 | Leica | DS9800 | |
| HistoClear II | National Diagnostics | HS-202 | |
| Permount封片剂 | Fisher Scientific | SP15 | |
| 抗p16抗体 | Santa Cruz | sc-56330 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞耐药模型建立 | 细胞系：C106和RW7213；药物浓度递增方案（sotorasib从0.1至3 μmol/L）；cetuximab浓度（50 μg/mL）；耐药建立时间（C106约4个月，RW7213约2个月） 阅读提示：Methods: Cell Lines and Compounds; Results: 第1段 |
| 患者队列及样本采集 | 患者例数（12例）；治疗方案（adagrasib+cetuximab或sotorasib+panitumumab）；采集时间点（基线和进展时）；ctDNA测序平台（Guardant360 CDx、ctDx FIRST、MSK-ACCESS） 阅读提示：Methods: Patients; Results: 第3-4段 |
| ctDNA纵向分析 | 采样频率（约每6周）；患者例数（4例）；分析指标（VAF、拷贝数、CEA水平） 阅读提示：Methods: DNA Sequencing; Results: 第4段 |
| 停药实验 | 停药时间点；细胞系（RW7213耐药细胞）；检测指标（β-半乳糖苷酶、Ki-67、p16、p21、p-ERK、p-S6、SASP） 阅读提示：Methods: 细胞培养及Western blotting; Results: 第5-6段 |
| 体内实验 | PDX模型（CLR113）；小鼠品系（NSG）；样本量（每组n=5）；给药方案（sotorasib 100 mg/kg每日，cetuximab 50 mg/kg每周两次，trametinib 3 mg/kg每日） 阅读提示：Methods: In Vivo Studies; Results: 第2段 |