验证SARS-CoV-2感染下调ACE2表达
确定SARS-CoV-2感染是否能降低ACE2蛋白水平
在Vero-E6和hACE2-HeLa细胞中感染SARS-CoV-2，通过Western blot检测ACE2蛋白水平变化。
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Spike介导的ACE2下调参与SARS-CoV-2感染的发病机制
Spike-mediated ACE2 down-regulation was involved in the pathogenesis of SARS-CoV-2 infection
实验完整度
高包含细胞感染模型、临床患者样本分析、转基因小鼠模型及多重分子机制验证（WB、RT-qPCR、RNA-seq、IHC），并进行了功能验证（Ang II诱导内皮细胞死亡）。
主要模型
hACE2-HeLa细胞 Vero-E6细胞 HPAEC人肺动脉内皮细胞 AC70 hACE2转基因小鼠
重点核对
SARS-CoV-2感染剂量MOI=0.3 Spike蛋白表达质粒转染剂量 Ang II处理浓度（50, 100, 500 nM） SARS-CoV-2感染时间点（2, 24, 48 h） 患者血浆样本量（健康对照n=11，COVID-19患者n=30）
摘要
持续全球大流行的2019冠状病毒病(COVID-19)对人类健康构成严重威胁，据报道，患者除患有急性和弥漫性肺损伤及呼吸系统疾病外，还患有血栓、血管损伤和凝血障碍。血管紧张素转换酶2(ACE2)作为SARS-CoV-2进入细胞的受体，也是肾素-血管紧张素系统(RAS)稳态的重要调节因子，其在COVID-19发病机制中的作用尚未确定。在此，我们证明SARS-CoV-2刺突蛋白激活细胞内信号以降解ACE2 mRNA。在COVID-19患者中证实了ACE2的降低和血管紧张素(Ang)II水平的升高。高剂量的Ang II在体外诱导肺动脉内皮细胞死亡，这在COVID-19患者的肺中也观察到。我们的发现表明，ACE2的下调可能将COVID-19与RAS失衡联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染如何通过Spike蛋白调控ACE2表达，并由此影响肾素-血管紧张素系统稳态及心血管病理？
- 核心机制
- SARS-CoV-2 Spike蛋白的S1亚基在感染细胞中激活细胞内信号，导致ACE2 mRNA降解，从而下调ACE2蛋白表达，进而削弱ACE2对Ang II的 cleavage，导致Ang II积聚，诱导肺血管内皮细胞损伤和功能障碍。
- 主要证据
- 在Vero-E6和hACE2-HeLa细胞中证实SARS-CoV-2感染降低ACE2表达；过表达Spike蛋白剂量依赖性地下调ACE2；COVID-19患者肺组织中ACE2表达减少，血浆Ang II水平升高；高浓度Ang II诱导HPAEC死亡，并在COVID-19患者肺中观察到内皮细胞凋亡。
- 研究意义
- 表明ACE2下调可能将COVID-19与RAS失衡联系起来，为理解SARS-CoV-2感染导致心血管并发症的机制提供了新见解，并提示在靶向ACE2治疗COVID-19时需注意患者RAS可能失调。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选下调ACE2的病毒蛋白
确定SARS-CoV-2中哪种蛋白负责ACE2下调
在hACE2-HeLa细胞中转染26种SARS-CoV-2病毒蛋白表达载体，通过Western blot检测ACE2蛋白水平。
验证Spike蛋白S1亚基的作用
确定Spike蛋白的哪个亚基负责ACE2下调
在HEK-293T细胞中共转染ACE2和Spike、Spike 1或Spike 2表达质粒，通过Western blot和荧光显微镜检测ACE2表达。
排除内吞途径参与ACE2下调
验证Spike介导的ACE2下调是否依赖病毒内吞过程
使用Spike假病毒感染hACE2-HeLa细胞，或直接用Spike蛋白刺激，检测ACE2表达；同时检测活病毒感染早期（2小时）和晚期（24小时）的ACE2水平。
排除蛋白降解途径参与ACE2下调
测试Spike介导的ACE2下调是否通过蛋白酶体或溶酶体途径
在共转染Spike和ACE2的HEK-293T细胞及SARS-CoV-2感染的hACE2-HeLa细胞中，分别加入蛋白酶体抑制剂MG132、溶酶体抑制剂E64D或Bafilomycin A1，检测ACE2表达。
验证ACE2 mRNA水平下调
确定Spike是否通过降低ACE2 mRNA水平导致蛋白下调
在SARS-CoV-2感染的Vero-E6和hACE2-HeLa细胞中，通过RT-qPCR检测ACE2 mRNA水平；利用RNA-seq分析ACE2转录变化；在过表达Spike的hACE2-HeLa细胞中检测ACE2 mRNA水平。
评估COVID-19患者RAS失调
验证ACE2下调是否导致患者Ang II水平升高
收集COVID-19患者和健康对照血浆，通过ELISA检测Ang II水平，并进行比较。
验证Ang II诱导内皮细胞损伤
研究高浓度Ang II是否直接导致内皮细胞损伤
用不同浓度Ang II刺激HPAEC细胞，检测细胞死亡和AT1R表达；并通过IHC检测COVID-19患者肺组织中c-casp3和VWF的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 改良Eagle培养基 | Gibco | -- | |
| Medium 200培养基 | -- | -- | |
| 低血清生长添加剂 | -- | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 药物处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Selleck Chemicals | S2619 |
| E64D溶酶体抑制剂 | Selleck Chemicals | S7393 | |
| 血管紧张素II | Cayman | ALX-151-039-M005 | |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPFL10100 |
| ACE2抗体 | Abcam | ab108209 | |
| SARS-CoV-2核蛋白抗体 | Sino Biological | 40588-T62 | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白抗体 | Sino Biological | 40591-MM42 | |
| Actin抗体 | TransGen Biotech | HC201 | |
| GAPDH抗体 | TransGen Biotech | HC301 | |
| AT-1R抗体 | Abcam | ab18801 | |
| AT-2R抗体 | Abcam | ab92445 | |
| 抗小鼠IgG | TransGen Biotech | HS201-01 | |
| 抗兔IgG | TransGen Biotech | HS101-01 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 高效cDNA逆转录试剂盒 | Takara | RR036A | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Vazyme | Q311-02 | |
| ELISA | 血管紧张素II ELISA试剂盒 | Sigma | RAB0010 |
| 免疫组织化学 | cleaved-Caspase3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 |
| VWF抗体 | Cell Signaling Technology | 65707S | |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| Western blot | SuperSignal West Pico化学发光底物 | Bio-Rad | -- |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | Sigma | M3148 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SARS-CoV-2感染实验 | 病毒感染剂量（MOI=0.3），感染时间（1小时），检测时间点（2, 24, 48小时），细胞系（Vero-E6, hACE2-HeLa） 阅读提示：Materials and methods - SARS-CoV-2 preparation and infection；Figure legends - Figure 1a, 2d, 4a-b |
| 质粒转染实验 | 质粒剂量（ACE2 1 μg，Spike 1 μg），转染试剂（Lipofectamine 2000），检测时间（转染后24小时），细胞系（HEK-293T, hACE2-HeLa, hACE2-293T） 阅读提示：Materials and methods - Cells, plasmids and reagents；Figure legends - Figure 1c, 1f, 1g, 4d |
| Ang II处理实验 | Ang II浓度（50, 100, 500 nM），处理时间（48小时），细胞系（HPAEC） 阅读提示：Materials and methods - Cells, plasmids and reagents；Figure legends - Figure 5b-c |
| 患者样本分析 | 样本量（健康对照n=11，COVID-19患者n=30），样本类型（血浆），检测方法（ELISA） 阅读提示：Materials and methods - Plasma angiotensin II measurement；Figure legends - Figure 5a |
| 动物实验 | 小鼠品系（AC70 CAG-hACE2转基因小鼠），年龄（6-8周），性别（雄性），感染剂量（1×10^4 PFU），感染体积（20 μl），感染途径（鼻内），处死时间（感染后第4天） 阅读提示：Materials and methods - Mice；Figure legends - Figure 1e |
| 抑制剂处理实验 | MG132浓度（5 μM），E64D浓度（10 μM），Bafilomycin A1浓度（200 nM），处理时间（2小时或4小时） 阅读提示：Materials and methods - Cells, plasmids and reagents；Figure legends - Figure 3a-b |