患者来源mSDH GIST模型的建立
从SDH突变型GIST患者肿瘤组织中分离并建立可持续培养的细胞模型。
将新鲜切除的肿瘤组织切成小块，用MACS人肿瘤解离试剂盒和gentleMACS解离器进行机械和酶解消化，过滤、离心后，将细胞接种在HTB9细胞外基质包被的培养瓶或培养板中，在含多种生长因子的培养基中培养。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
建立患者来源的琥珀酸脱氢酶缺陷型胃肠道间质瘤模型以预测治疗反应
Establishment of Patient-Derived Succinate Dehydrogenase-Deficient Gastrointestinal Stromal Tumor Models for Predicting Therapeutic Response
实验完整度
高包含体外细胞模型建立与表征、代谢与转录组分析、药物敏感性及机制验证（DNA损伤、凋亡），并延伸至患者临床疗效回顾性分析，涵盖多个独立证据层级。
主要模型
患者来源的SDHA突变GIST细胞模型SD-437A 患者来源的SDHB突变GIST细胞模型SD-424B 患者来源的SDHC突变GIST细胞模型SD-435C KIT突变/SDH野生型GIST细胞系GIST882（对照）
重点核对
细胞模型需在HTB9细胞来源的细胞外基质上培养，并可在Poly-HEMA包被培养皿中形成球体。 体外药物处理使用500 μM替莫唑胺处理72小时或7天，或梯度浓度处理3-7天。 患者临床数据来自2016-2018年间接受替莫唑胺治疗的5例SDH缺陷型GIST患者，给药方案为85 mg/m²/天，21天/28天周期。 模型经STR DNA分型验证，与ATCC数据库比对，确保无其他细胞系污染。 患者肿瘤和组织样本获取需经UCSD机构审查委员会批准并获得知情同意。
摘要
目的：胃肠道间质瘤是胃肠道最常见的肉瘤，其中突变型琥珀酸脱氢酶亚基（A-D）在美国每年新发病例中占比不足7.5%（即每年150-200例）。与携带KIT或PDGFRA突变的GIST相反，SDH突变型GIST影响青少年/年轻人，常发生转移，且通常对酪氨酸激酶抑制剂耐药。缺乏任何SDH突变型肿瘤（包括GIST）的人类模型限制了分子特征研究和药物发现。实验设计：我们描述了建立新型患者来源的SDH突变型GIST模型的方法，并在体外及mSDH GIST患者的临床试验中探究了替莫唑胺对这些肿瘤模型的疗效。结果：对我们患者来源的mSDH GIST模型的分子和代谢特征分析显示，这些模型重现了亲本肿瘤和SDH缺陷的转录和代谢特征。我们进一步证明替莫唑胺在我们的mSDH GIST模型中引发DNA损伤和细胞凋亡。将我们的体外发现转化到临床，一组接受替莫唑胺治疗的SDH突变型GIST患者（n=5）显示40%的客观缓解率和100%的疾病控制率，表明替莫唑胺可能是这一类GIST的一种有前景的疗法。结论：我们首次报道了建立患者来源的mSDH肿瘤模型的方法，该方法可易于用于理解患者特异性肿瘤生物学和治疗策略。我们还证明替莫唑胺对临床上对其他现有化疗药物（即TKI）难治的mSDH GIST患者有效，为这些患者带来了一种有前景的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究旨在建立患者来源的SDH突变型GIST模型，并评估替莫唑胺对这些模型的体外疗效及其在TKI耐药SDH缺陷型GIST患者中的临床疗效。
- 核心机制
- 替莫唑胺通过诱导DNA损伤（γ-H2AX增加），同时降低MGMT修复蛋白表达，并上调p21、DR5和cleaved caspase 3，导致细胞周期阻滞和细胞凋亡。
- 主要证据
- 体外实验显示替莫唑胺在mSDH GIST模型中剂量依赖性降低细胞活力，并诱导DNA双链断裂和凋亡标志物；临床回顾性分析显示5例患者中2例部分缓解，3例疾病稳定，疾病控制率100%。
- 研究意义
- 研究者认为该模型可用于个性化药物筛选和基础/转化研究，且表明替莫唑胺对TKI耐药的SDH缺陷型GIST患者是一种有前景的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
模型特征验证
验证建立的模型是否重现亲本肿瘤的关键特征，包括GIST标志物表达、SDHB缺失、代谢和转录特征。
通过免疫荧光检测KIT和DOG-1表达，免疫印迹和免疫荧光检测SDHB和SDHA蛋白水平，RNA测序和GSEA分析转录组，质谱法检测代谢物水平，海马分析仪测定线粒体呼吸功能。
药物敏感性测试
评估模型对酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼、舒尼替尼）和替莫唑胺的敏感性。
细胞种板后，分别用不同浓度的伊马替尼、舒尼替尼和替莫唑胺处理，使用CellTiter-Glo试剂盒检测细胞活力，计算IC50。
替莫唑胺作用机制验证
验证替莫唑胺是否诱导DNA损伤和细胞凋亡，并探索其机制。
用500 μM替莫唑胺处理细胞72小时或7天，通过中性彗星实验检测DNA双链断裂，免疫荧光检测γ-H2AX，免疫印迹检测p21、DR5、cleaved caspase 3、MGMT和γ-H2AX蛋白水平。
临床疗效回顾性分析
评估替莫唑胺在TKI耐药的SDH缺陷型GIST患者中的临床疗效。
回顾性分析了2016年至2018年间在本机构接受替莫唑胺治疗的5例广泛转移性SDH缺陷型GIST患者，通过RECIST v1.1和PERCIST标准评估肿瘤反应，并使用Kaplan-Meier方法分析生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | 10-040-CM |
| 胎牛血清 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| 最小必需培养基非必需氨基酸 | Gibco | 11140050 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 干细胞因子 | Peprotech | 300-07 | |
| 胰岛素样生长因子-1 | Peprotech | 100-11 | |
| B-27无血清补充剂 | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Corning | 30-004-CI | |
| TrypLE Express消化液 | Gibco | 12605028 | |
| 细胞解离 | MACS人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| gentleMACS解离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| MACS SmartStrainer 70μm过滤器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | 台盼蓝 | -- | -- |
| 细胞计数 | TC20自动细胞计数器 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 细胞培养 | HTB-9细胞系 | -- | -- |
| 聚甲基丙烯酸羟乙酯 | Sigma-Aldrich | P3932 | |
| 软琼脂集落形成实验 | SeaPlaque琼脂糖 | Lonza | -- |
| 甲基纤维素实验 | 甲基纤维素 | R & D Systems | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| NuPAGE 4%-12% Bis Tris凝胶 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SDHA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166909 | |
| SDHB抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-271548 | |
| HIF1A抗体 | ThermoFisher Scientific | MA1-516 | |
| HIF2A抗体 | Proteintech | 26422-1-AP | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Invitrogen | -- | |
| Pierce ECL蛋白质印迹检测系统 | ThermoFisher Scientific | 32109 | |
| DR5抗体 | Cell Signaling Technology | 8074 | |
| p21 Waf1/Cip1抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| Cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| MGMT抗体 | Cell Signaling Technology | 2739 | |
| γ-H2AX抗体 | Cell Signaling Technology | 2577 | |
| α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 正常驴血清 | -- | -- | |
| c-KIT抗体 | Dako | A4502 | |
| DOG-1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-377115 | |
| Alexa Fluor偶联二抗 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| ProLong Gold防淬灭封片剂 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | -- | |
| 5-甲基胞嘧啶抗体 | Cell Signaling Technology | 28692 | |
| 5-羟甲基胞嘧啶抗体 | Cell Signaling Technology | 51660 | |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 驴抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | 尼康Eclipse C1共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 基恩士BZ-X710荧光显微镜 | Keyence Corporation | -- | |
| RNA提取 | RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- |
| 无RNase的DNase套装 | Qiagen | -- | |
| RNA质量检测 | NanoDrop 2000c分光光度计 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 安捷伦Tapestation | Agilent | -- | |
| RNA测序 | TruSeq链特异性mRNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | -- | |
| 基因组分析 | FoundationOne检测 | Foundation Medicine, Inc. | -- |
| Wizard DNA提取试剂盒 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | 替莫唑胺 | Selleckchem | S1237 |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | Selleckchem | 25972 | |
| 6-氨基烟酰胺 | ThermoFisher Scientific | AAL0669203 | |
| 伊马替尼 | Chemietek | -- | |
| 苹果酸舒尼替尼 | ThermoFisher Scientific | 341031-54-7 | |
| CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 | Promega Corporation | G7572 | |
| MTT试剂 | Sigma | -- | |
| 彗星实验 | Trevigen彗星实验试剂盒 | Trevigen | -- |
| 代谢物提取 | 甲醇 | -- | -- |
| 氯仿 | -- | -- | |
| GC/MS分析 | 甲氧胺盐酸盐 | MP Biomedicals | -- |
| DB-35MS色谱柱 | Agilent J&W Scientific | -- | |
| 安捷伦7890B气相色谱系统 | Agilent | -- | |
| 安捷伦5977a质谱仪 | Agilent | -- | |
| 呼吸实验 | Seahorse XF96分析仪 | Agilent | -- |
| 产气荚膜杆菌溶血素O | -- | -- | |
| ADP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 琥珀酸 | -- | -- | |
| 苹果酸 | -- | -- | |
| FCCP解偶联剂 | -- | -- | |
| 数据统计 | Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者来源细胞模型建立 | 肿瘤组织来源、解离方法、培养基成分、细胞外基质类型（HTB9）及培养条件。 阅读提示：Materials and Methods: Human GIST Samples, Tumor Dissociation and Primary Cell Culture |
| 细胞培养条件 | 细胞系（SD-437A, SD-424B, SD-435C）在HTB9基质上的培养密度、培养基成分及传代次数。 阅读提示：Materials and Methods: Tumor Dissociation and Primary Cell Culture, Cell Lines |
| 药物处理 | 替莫唑胺、伊马替尼、舒尼替尼的处理浓度、时间及溶剂对照。 阅读提示：Materials and Methods: Measurement of Cell Viability; Results section for drug concentrations |
| DNA损伤检测 | 中性彗星实验和γ-H2AX免疫荧光染色中细胞处理条件（如500 μM TMZ, 72 h）及分析方法。 阅读提示：Materials and Methods: Comet Tail Assay for DNA Damage, Immunofluorescence and Confocal Microscopy |
| 临床疗效分析 | 患者样本量（n=5）、给药方案（85 mg/m²/天，21天给药/7天休息）、疗效评估标准（RECIST v1.1和PERCIST）及统计设计。 阅读提示：Materials and Methods: Patient Response; Results: Clinical efficacy of TMZ |