临床试验评估MTL-CEBPA与索拉非尼联合治疗HCC患者
评估MTL-CEBPA联合索拉非尼在晚期HCC患者中的安全性、耐受性和抗肿瘤活性
36例HCC患者接受MTL-CEBPA（90或130 mg/m²每周一次）和索拉非尼（400 mg每日两次）的联合或序贯治疗，评估肿瘤反应和安全性。
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上调C/EBPα抑制髓系细胞的抑制活性并增强小鼠和癌症患者的抗肿瘤反应
Upregulation of C/EBPα Inhibits Suppressive Activity of Myeloid Cells and Potentiates Antitumor Response in Mice and Patients with Cancer
实验完整度
高包含I期临床试验、多种小鼠肿瘤模型（BNL、LLC、MC38）、细胞功能实验（T细胞抑制实验）、RNA-seq和蛋白质组学等多层级验证。
主要模型
小鼠肝癌细胞系BNL 1ME A.7R.1 Lewis肺癌细胞系LLC 结肠腺癌细胞系MC38 HCC患者样本
重点核对
MTL-CEBPA剂量：90或130 mg/m²每周一次 索拉非尼剂量：400 mg每日两次 小鼠给药：MTL-CEBPA 3 mg/kg静脉注射每周两次 T细胞耗竭：抗小鼠CD8a抗体100 μg腹腔注射 联合治疗：抗PD-1抗体10 mg/kg每周两次
摘要
目的：评估治疗性上调转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）在晚期肝细胞癌（HCC）患者和不同小鼠肿瘤模型中阻止肿瘤进展的机制。实验设计：我们在36例HCC患者（NCT02716012）中进行了一项I期试验，这些患者接受索拉非尼作为标准治疗的一部分，并接受治疗性C/EBPα小激活RNA（saRNA；MTL-CEBPA）作为新辅助或辅助治疗。在临床前环境中，在几种小鼠模型中评估了MTL-CEBPA的效果，包括BNL-1ME肝癌、Lewis肺癌（LLC）和结肠腺癌（MC38）。结果：MTL-CEBPA治疗在具有病毒病因的HCC患者中引起26.7%的患者肿瘤影像学消退，其中3例完全缓解。这些患者中的MTL-CEBPA治疗导致外周血单核细胞髓源性抑制细胞（M-MDSC）数量显著减少，以及促肿瘤M2肿瘤相关巨噬细胞（TAM）总数减少。治疗后患者白细胞基因和蛋白质分析显示CEBPA激活影响了参与免疫抑制活性的因子的调节。为了证实这一观察结果，用MTL-CEBPA治疗所有小鼠肿瘤模型导致M-MDSC和TAM的抑制活性逆转，但对多形核MDSC（PMN-MDSC）没有影响。MTL-CEBPA在这些肿瘤模型中的抗肿瘤作用显示对T细胞的依赖性。当MTL-CEBPA与检查点抑制剂或靶向PMN-MDSC的免疫疗法联合使用时，这种作用得到加强。结论：本报告证明治疗性上调转录因子C/EBPα导致免疫抑制性髓系细胞失活，并在不同肿瘤模型和癌症患者中产生有效的抗肿瘤反应。MTL-CEBPA目前正在一项I/Ib期多中心临床研究（NCT04105335）中与帕博利珠单抗联合研究。转化相关性：在本文中，我们展示了跨一系列肿瘤类型的临床前数据，这些数据确立了MTL-CEBPA调节髓系细胞的作用机制。与索拉非尼联合治疗的安全性在一项Ib期临床试验中得到确认，该试验在酪氨酸激酶抑制剂初治的病毒病因肝细胞癌患者亚组中显示出强烈的疗效信号。这些数据为在其他原发肿瘤类型中与免疫疗法联合治疗提供了证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 治疗性上调C/EBPα是否能通过抑制髓系细胞的免疫抑制活性来阻止肿瘤进展？
- 核心机制
- MTL-CEBPA上调C/EBPα，导致M-MDSC和TAM的免疫抑制活性逆转，并通过T细胞依赖性机制发挥抗肿瘤作用。
- 主要证据
- 临床试验显示病毒性病因HCC患者中26.7%的客观缓解率，3例完全缓解；小鼠模型中MTL-CEBPA治疗导致肿瘤生长减缓，且CD8+ T细胞耗竭后抗肿瘤效应消失。
- 研究意义
- 为联合免疫治疗提供了理论基础，MTL-CEBPA与帕博利珠单抗联合的临床试验正在进行。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析患者外周血髓系细胞的变化
评估MTL-CEBPA治疗对患者外周血M-MDSC、PMN-MDSC及基因表达的影响
通过流式细胞术检测治疗前后M-MDSC和PMN-MDSC的比例，通过NanoString和qRT-PCR分析基因表达变化。
小鼠肿瘤模型验证MTL-CEBPA的抗肿瘤作用
在多个小鼠肿瘤模型中验证MTL-CEBPA的抗肿瘤效果及其免疫依赖性
在BNL、LLC和MC38荷瘤小鼠中给予MTL-CEBPA（3 mg/kg静脉注射，每周两次），监测肿瘤生长。在LLC模型中进行CD8+ T细胞耗竭实验。
评估MTL-CEBPA对髓系细胞抑制功能的影响
验证MTL-CEBPA是否逆转M-MDSC、TAM和PMN-MDSC的T细胞抑制活性
从LLC或MC38荷瘤小鼠的脾脏和肿瘤中分离M-MDSC、TAM和PMN-MDSC，与PMEL小鼠脾细胞共培养，检测T细胞增殖。
RNA-seq分析TAM和PMN-MDSC的转录组变化
揭示MTL-CEBPA处理后TAM和PMN-MDSC中差异表达的基因和通路
分选LLC荷瘤小鼠肿瘤中的TAM和PMN-MDSC，进行RNA-seq分析，使用DESeq2和IPA通路分析。
联合治疗增强抗肿瘤效果
评估MTL-CEBPA与检查点抑制剂、COX-2抑制剂或PMN-MDSC抑制剂联合的疗效
在MC38或LLC荷瘤小鼠中，将MTL-CEBPA与抗PD-1、抗CTLA-4、塞来昔布或脂质体fermata联合治疗，监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning Incorporated | -- |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals, Inc. | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- | |
| 胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific Inc. | -- | |
| 药物处理 | MTL-CEBPA | MiNA Therapeutics Ltd | -- |
| NOV-FLUC | MiNA Therapeutics Ltd | -- | |
| 索拉非尼 | -- | -- | |
| T细胞耗竭 | 抗小鼠CD8a抗体 | Bio X Cell | BE0004-1 |
| 大鼠IgG2a同型对照抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 联合治疗 | 抗小鼠CTLA-4抗体 | Bio X Cell | BE0164 |
| 小鼠IgG2b同型对照抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 塞来昔布 | Selleck Chemicals | -- | |
| Lipofermata | Selleck Chemicals | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Life Technologies | -- |
| 细胞增殖检测 | CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒（MTS实验） | Promega | -- |
| 细胞分离 | 小鼠肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| 生物素化Ly6G抗体 | -- | -- | |
| 链霉亲和素微珠 | Miltenyi | -- | |
| 流式分析 | FACSAria流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| LSR II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | FlowJo, LLC. | -- | |
| qRT-PCR | Quick-RNA MicroPrep试剂盒 | Zymo Research | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantiTect引物检测 | Qiagen | -- | |
| 体内示踪 | Cy3标记的MTL-CEBPA | MiNA Therapeutics Ltd | -- |
| IHC | 抗CD68抗体 | Abcam | ab213363 |
| 抗CD163抗体 | Bio-Rad | MCA1853 | |
| 抗LOX1抗体 | Merck Millipore | MABS186 | |
| 抗CD11B抗体 | Cell Signaling Technology | 49420S | |
| 抗CD15抗体 | BD Biosciences | 555400 | |
| 抗CD14抗体 | Cell Marque | 114R-15 | |
| 抗S100A9抗体 | Origene | UM800066 | |
| 抗IL10抗体 | R&D Systems | MAB92101 | |
| 抗TNFα抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| 抗MPO抗体 | Abcam | ab93665 | |
| 抗IDO抗体 | Thermo Fisher | 14-9750-82 | |
| 抗CD64抗体 | Abcam | ab140779 | |
| 抗CD163抗体 | Abcam | ab182422 | |
| 抗CD86抗体 | Cell Signaling Technology | 91882S | |
| 抗CD206抗体 | R&D Systems | MAB25341 | |
| Emerald抗体稀释液 | ESBE Scientifique | CMQ-936B09 | |
| MACH 2兔HRP聚合物 | Biocare | RHRP520L | |
| MACH 4通用HRP聚合物 | Biocare | M4U534L | |
| AEC过氧化物酶底物试剂盒 | Biocare | SK-4200 | |
| ImmPACT AMEC Red | Vector Lab | SK-4285 | |
| VectaMount AQ封片剂 | VECTOR Laboratories | H-5501 | |
| NanoZoomer-XR扫描仪 | Hamamatsu | -- | |
| Leica Bond RX自动染色仪 | Leica Biosystems | -- | |
| Bond抗原修复液#2 | Leica Biosystems | -- | |
| 数据分析 | HALO软件 | Indica Labs | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| 蛋白质组学 | OASIS HLB柱 | Waters | -- |
| TiO2色谱介质 | -- | -- | |
| LTQ-orbitrap质谱仪 | -- | -- | |
| Mascot Distiller（版本1.2） | Matrix Science | -- | |
| Mascot搜索引擎（版本2.3） | Matrix Science | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者治疗 | MTL-CEBPA剂量（90或130 mg/m²），给药频率（每周一次），索拉非尼剂量（400 mg每日两次），治疗周期（28天），患者纳入标准（Child-Pugh ≤ B8，ECOG 0-1） 阅读提示：Materials and Methods: Study design and participants |
| 小鼠肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6，BALB/c），细胞系（LLC，MC38，BNL 1ME A.7R.1），细胞接种数量（5 × 10^5），MTL-CEBPA剂量（3 mg/kg，每周两次） 阅读提示：Materials and Methods: Animal experiments, Cell lines, Reagents and treatment |
| T细胞抑制实验 | 效应细胞（M-MDSC，TAM，PMN-MDSC），靶细胞（PMEL小鼠脾细胞），刺激物（gp100肽，0.1 μg/mL），共培养时间（48小时），3H-胸苷掺入时间（16小时） 阅读提示：Materials and Methods: T-cell suppression assay |
| RNA-seq分析 | TAM和PMN-MDSC的分选，处理（MTL-CEBPA或NOV-FLUC），差异表达基因阈值（P < 0.05），通路分析（IPA Z-score ≥ 2） 阅读提示：Materials and Methods: RNA-seq |
| 联合治疗 | 抗PD-1剂量（10 mg/kg，每周两次），抗CTLA-4剂量（100 μg/只，第10、17、24天），塞来昔布剂量（50 mg/kg，每日口服），lipofermata剂量（2 mg/kg，每日两次皮下注射） 阅读提示：Materials and Methods: Reagents and treatment, Results: Therapeutic effect of MTL-CEBPA |