RNAi合成致死筛选
鉴定能增敏卵巢癌顺铂耐药细胞对顺铂反应的代谢激酶。
在A2780cisR和SK-OV-3cisR细胞中，使用靶向代谢激酶的shRNA文库进行筛选，并给予亚致死剂量顺铂处理，评估细胞活力。
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DGKA通过激活c-JUN-WEE1信号通路在卵巢癌中赋予铂耐药性
DGKA Provides Platinum Resistance in Ovarian Cancer Through Activation of c-JUN-WEE1 Signaling
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内异种移植瘤模型、患者来源异种移植瘤模型及患者肿瘤样本分析，并进行了功能验证（敲低/过表达/突变）和机制验证（磷酸化蛋白质组学、ChIP、报告基因等）。
主要模型
A2780cisR人卵巢癌细胞系 SK-OV-3cisR人卵巢癌细胞系 A2780cisR异种移植瘤裸鼠模型 卵巢癌患者来源异种移植瘤(PDX)模型
重点核对
RNAi筛选使用的代谢激酶shRNA文库来源（Dharmacon）及筛选浓度 DGKA激酶活性对耐药性影响的功能验证（野生型与G434A激酶死亡突变体） PA（磷脂酸）作为关键信号分子的验证（外源PA回补实验） c-JUN激活及WEE1表达调控的机制验证（磷酸化蛋白质组学、ChIP、启动子报告基因） DGK抑制剂R59949在体外和PDX模型中的增敏效果及患者肿瘤样本中的相关性
摘要
目的：尽管铂类化合物是卵巢癌的一线治疗药物，但大多数患者会复发并对治疗产生耐药性。然而，耐药的潜在机制尚不清楚。我们研究的目标是阐明代谢激酶二酰甘油激酶α（DGKA）赋予卵巢癌铂耐药性的机制。实验设计：使用代谢激酶RNAi合成致死筛选来鉴定卵巢癌中的顺铂耐药驱动因子。使用DGKA变体证明DGKA活性在顺铂耐药中的必要性。进行磷酸化蛋白质组学和基因组筛选以鉴定DGKA的下游效应因子。靶向DGKA的治疗效果得到证实，并使用对铂类治疗反应不同的卵巢癌患者来源肿瘤验证了DGKA信号传导的临床相关性。结果：我们发现铂耐药性是由卵巢癌中的DGKA及其产物磷脂酸（PA）介导的。蛋白质组学和基因组筛选揭示，DGKA激活转录因子c-JUN，从而增强细胞周期调节因子WEE1的表达。机制上，PA促进JNK招募至c-JUN并促进其核定位，导致顺铂暴露时c-JUN的激活。药理学抑制DGKA使卵巢癌细胞对顺铂治疗敏感，且DGKA-c-JUN-WEE1信号传导与卵巢癌患者来源肿瘤中的铂耐药性呈正相关。结论：我们的研究展示了DGKA来源的脂质信使PA如何通过与激酶和转录网络交织来促进顺铂耐药性，并为靶向DGKA作为卵巢癌治疗中对抗顺铂耐药性的新策略提供了临床前证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 代谢激酶DGKA及其产物PA是否以及如何通过调控下游信号网络赋予卵巢癌铂耐药性。
- 核心机制
- DGKA产生的PA促进JNK与c-JUN的结合及核转位，激活c-JUN转录活性，进而上调细胞周期检查点激酶WEE1的表达，从而促进DNA损伤修复和细胞存活，介导铂耐药。
- 主要证据
- RNAi筛选和功能实验证明DGKA敲低或抑制可增敏卵巢癌细胞对顺铂的反应；磷酸化蛋白质组学、CETSA、SPR和ChIP等实验证明PA增强c-JUN-JNK相互作用和核定位，并直接调控WEE1转录；PDX模型和患者肿瘤样本分析验证了该信号轴与铂耐药的相关性。
- 研究意义
- 研究揭示DGKA-c-JUN-WEE1信号轴是卵巢癌铂耐药的关键机制，为靶向DGKA联合铂类化疗以克服耐药提供了临床前证据，并提示DGKA信号可作为预测铂类化疗反应的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DGKA功能验证
验证DGKA及其激酶活性在卵巢癌细胞顺铂耐药中的必要性。
通过敲低DGKA、回补野生型或激酶死亡突变体（G434A），检测细胞活力、集落形成、凋亡和异种移植瘤生长。
PA介导的机制探究
探究DGKA是否通过其产物PA介导顺铂耐药，以及PA的作用机制。
检测DGKA敲低后细胞内PA水平，回补外源PA或LPA，并利用CETSA、SPR、免疫荧光等实验证明PA促进c-JUN与JNK结合及核转位。
下游靶基因鉴定与验证
鉴定DGKA-c-JUN信号通路的下游效应因子并验证其功能。
利用RT-qPCR分析DGKA或c-JUN敲低细胞中潜在靶基因的表达，并通过ChIP和启动子报告基因实验验证WEE1为c-JUN的直接靶标。
体内药效与临床相关性评估
评估DGK抑制剂（R59949）在体内模型中的增敏效果，并验证DGKA信号轴与卵巢癌患者铂耐药的相关性。
使用卵巢癌PDX模型评估R59949联合顺铂的抗肿瘤效果；通过免疫印迹和IHC检测患者肿瘤样本中DGKA、p-c-JUN和WEE1的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低 | shRNA慢病毒质粒 | Dharmacon | -- |
| 基因突变构建 | 定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 脂质处理 | 1,2-二辛酰基-sn-甘油-3-磷酸（磷脂酸） | Avanti Polar Lipids | -- |
| 1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油（二酰甘油） | Sigma Aldrich | -- | |
| 药物处理 | DGK抑制剂II (R59949) | Sigma Aldrich | -- |
| 顺铂 | -- | -- | |
| MK-1775 | Selleckchem | -- | |
| 蛋白检测 | 抗DGKA抗体 | Proteintech | -- |
| 抗磷酸化c-JUN Ser63抗体 | Cell Signaling Technology | 9261 | |
| 抗WEE1抗体 | Cell Signaling Technology | 13084 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma Aldrich | A1978 | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| McCoy's 5A培养基 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 激酶活性检测 | ADP-Glo激酶活性检测试剂盒 | Promega | -- |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 逆转录 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| qPCR | Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- |
| 脂质检测 | 荧光PicoProbe磷脂酸检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 核质分离 | NE-PER核和胞质提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白相互作用 | Biacore X100 | -- | -- |
| 蛋白检测 | 抗Ki-67抗体 | Abcam | ab92742 |
| 代谢检测 | D-[U-14C]-葡萄糖 | -- | -- |
| ATP生物发光体细胞检测试剂盒 | Sigma Aldrich | -- | |
| 凋亡检测 | FITC标记的膜联蛋白V | BD Pharmingen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNAi筛选 | shRNA文库、筛选浓度、处理时间 阅读提示：MATERIALS and METHODS: RNAi, phospho-proteomic, and genomic screens；Figure 1 legend |
| DGKA功能验证 | DGKA敲低效率、回补突变体、顺铂剂量、处理时间、细胞活力/凋亡检测方法 阅读提示：MATERIALS and METHODS: Cell culture and generation of cell lines, Cell viability assay and colony formation assay；Figure 1 legend |
| PA作用验证 | PA/LPA浓度、细胞内PA检测方法、外部PA回补条件 阅读提示：MATERIALS and METHODS: Reagents；Figure 2 legend |
| 机制研究 | 磷酸化激酶芯片分析条件、CETSA温度梯度、SPR分析条件、免疫荧光染色条件 阅读提示：MATERIALS and METHODS: RNAi, phospho-proteomic, and genomic screens, Cellular thermal shift assay, Surface plasmon resonance, Immunofluorescence staining；Figure 3 legend |
| 下游靶基因验证 | RT-qPCR引物、ChIP实验条件、WEE1启动子报告基因检测方法、细胞周期分析条件 阅读提示：MATERIALS and METHODS: Real time-qPCR, WEE1 promoter reporter assay；Figure 5 legend |
| 体内药效与临床相关性 | 异种移植瘤模型构建、给药方案（剂量、途径、频率）、PDX模型处理、患者肿瘤样本分组标准、IHC染色条件 阅读提示：MATERIALS and METHODS: Xenograft studies, Immunohistochemistry staining；Figure 6 legend |