验证VHL/低氧对TBK1磷酸化的调控
确定VHL缺失或低氧是否影响TBK1磷酸化及活性。
在多个肾癌细胞系中比较VHL缺失与恢复的TBK1磷酸化水平，并进行体外激酶实验检测STING磷酸化。
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TBK1是VHL缺失癌症中的合成致死靶点
TBK1 Is a Synthetic Lethal Target in Cancer with VHL Loss
实验完整度
高包含体外细胞实验、原位异种移植模型、临床样本分析、磷酸化蛋白质组学及机制验证等至少两个独立证据层级。
主要模型
VHL缺失的肾癌细胞系（786-O、UMRC2、RCC4、UMRC6） VHL野生型细胞系（293T、Caki-1、HKC） 肾癌原位异种移植小鼠模型（NSG小鼠） 肾癌患者肿瘤组织及组织芯片（TMA）
重点核对
VHL缺失状态及TBK1磷酸化水平 TBK1抑制剂CMPD1处理浓度及时间 TBK1 PROTAC UNC6587的浓度及处理时间 原位异种移植模型中肿瘤细胞注射数量及DOX诱导条件 临床样本中TBK1磷酸化与VHL表达的关系
摘要
TANK结合激酶1（TBK1）是参与先天免疫反应的重要激酶。在这里我们发现，在癌细胞中，TBK1因von Hippel-Lindau（VHL）缺失或缺氧而过度激活。来自VHL缺失的肾癌患者的肿瘤表现出升高的TBK1磷酸化。通过基因消融、药理抑制或新的基于Cereblon的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）来缺失TBK1，可特异性抑制VHL缺陷的肾癌细胞生长，而VHL野生型细胞不受影响。TBK1缺失也显著抑制原位异种移植模型中的肾脏肿瘤发生。机制上，TBK1在脯氨酸48位点的羟基化触发VHL以及磷酸酶PPM1B的结合，导致TBK1磷酸化降低。我们确定TBK1磷酸化p62/SQSTM1的Ser366位点，这对p62稳定性及肾癌细胞增殖至关重要。我们的结果确立，TBK1不同于其在先天免疫信号传导中的作用，是VHL缺失癌症中的合成致死靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TBK1在癌症中如何被激活，以及这种激活是否与其在先天免疫中的作用相关。
- 核心机制
- VHL缺失或低氧抑制EglN1介导的TBK1脯氨酸48位点羟基化，减少TBK1与VHL及磷酸酶PPM1B的结合，导致TBK1磷酸化增强，进而磷酸化p62的Ser366位点，稳定p62并促进肾癌肿瘤发生。
- 主要证据
- 通过VHL缺失或恢复的肾癌细胞系、EglN1敲除细胞、体外激酶实验、磷酸化蛋白质组学、原位异种移植模型及临床样本免疫组化分析，证明TBK1磷酸化增加及p62 Ser366磷酸化对肾癌生长至关重要。
- 研究意义
- TBK1作为VHL缺失肾癌的合成致死靶点，为肾癌治疗提供新策略，并可能增强免疫检查点抑制剂疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定TBK1羟基化及VHL相互作用的机制
确定具体羟基化位点及VHL如何调控TBK1磷酸化。
通过质谱鉴定TBK1羟基化位点，构建突变体，进行免疫共沉淀和体外结合实验，验证羟基化对TBK1-VHL相互作用及TBK1磷酸化的影响。
验证TBK1缺失/抑制对VHL缺失细胞生长的影响
验证TBK1是否是VHL缺失肾癌细胞的合成致死靶点。
使用CRISPR-Cas9敲除TBK1或使用TBK1抑制剂（CMPD1、BX795、MRT67307）及PROTAC处理，检测细胞增殖和软琼脂集落形成。
验证体内TBK1缺失对肿瘤生长的影响
评估TBK1缺失在体内对肾癌肿瘤生长和转移的影响。
将UMRC2细胞原位注射至NSG小鼠肾包膜，诱导TBK1 shRNA表达，监测肿瘤生长和自发转移。
临床样本中TBK1磷酸化水平的分析
验证TBK1磷酸化在肾癌患者中的临床相关性。
通过免疫组化检测肾癌组织和正常组织中TBK1和pTBK1水平，并与VHL表达关联。
鉴定TBK1新底物p62并验证其磷酸化
鉴定TBK1在肾癌中的直接底物并验证其功能重要性。
通过磷酸化蛋白质组学筛选，体外激酶实验验证TBK1磷酸化p62 Ser366，并通过突变及回补实验检测对细胞增殖的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素链霉素 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3504 |
| pTBK1 (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| IKKε抗体 | Cell Signaling Technology | 2905 | |
| pIKKε (Ser172)抗体 | Cell Signaling Technology | 8766 | |
| STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| pSTING (Ser366)抗体 | Cell Signaling Technology | 19781 | |
| VHL抗体 | Cell Signaling Technology | 68547 | |
| EglN1抗体 | Cell Signaling Technology | 3293 | |
| HIF1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3716 | |
| p62抗体 | Cell Signaling Technology | 39749 | |
| GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625 | |
| HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| FLAG标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| cleaved-caspase3抗体 | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| α-Tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | 3873 | |
| HIF2α抗体 | Abcam | ab157249 | |
| TBK1抗体 | Abcam | ab12116 | |
| EglN1抗体 | Abcam | ab103432 | |
| PPM1B抗体 | Abcam | ab70804 | |
| Ub抗体 | Santa Cruz | 8017 | |
| p62 phospho-Ser366抗体 | Affinity BioSciences | AF7374 | |
| 过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗 | Thermo Scientific | 31430 | |
| 过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗 | Thermo Scientific | 31460 | |
| 药物处理 | 二甲基草酰甘氨酸 | Frontier Scientific | D1070-1g |
| 去铁胺 | Millipore-Sigma | D9533-1G | |
| BX-795 | Millipore-Sigma | 204001-10mg | |
| MRT67307 | Millipore-Sigma | 506306-5mg | |
| 巴佛洛霉素A1 | Millipore-Sigma | B1793 | |
| FG4592 | Cayman Chemical | 15294-25mg | |
| CMPD1 | WuxiAPP Tech | -- | |
| 蛋白检测 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 质谱分析 | 尿素 | Sigma | U4883 |
| 二硫苏糖醇 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| SepPak C18固相萃取柱 | Waters | 100mg sorbent | |
| Pierce定量比色肽测定试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| TMT 10-plex标记试剂 | Thermo Fisher | -- | |
| 羟胺 | -- | -- | |
| 三乙基碳酸氢铵缓冲液 | -- | -- | |
| MagReSyn Ti-MAC磁珠 | ReSyn Biosciences | -- | |
| Easy nLC 1200液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| QExactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Easy Spray PepMap C18色谱柱 | Thermo Scientific | 75 μm id × 25 cm | |
| 体外实验 | FLAG M2亲和凝胶 | Sigma | -- |
| NeutrAvidin琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 29200 | |
| GST亲和凝胶 | GE Healthcare | -- | |
| GST-TBK1蛋白 | SignalChem | T02-10G | |
| 重组人p62蛋白 | Enzo Life Sciences | -- | |
| 重组人STING蛋白 | Active Motif | 81182 | |
| 动物实验 | 多西环素 | Research Diets, Inc. | -- |
| Purina啮齿动物饲料#5001 | Research Diets, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源及培养条件（DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）、传代次数（10-20代）、支原体阴性 阅读提示：Methods, Cell Culture |
| VHL状态调控 | VHL缺失细胞系（786-O, UMRC2, RCC4, UMRC6）及VHL恢复细胞（稳定表达VHL），VHL敲除细胞（293T, Caki-1） 阅读提示：Methods, Cell Culture; Results Section VHL Suppresses TBK1 Activity |
| 低氧处理 | 1% O2处理时间（过夜），或低氧模拟物（DMOG、DFO、FG4592）浓度 阅读提示：Results Section VHL Suppresses TBK1 Activity; Figure 1F; Supplementary Figure S1E-G |
| 蛋白检测 | 抗体、工作浓度、孵育条件 阅读提示：Methods, Antibodies and Reagents |
| 免疫沉淀 | 细胞裂解液、抗体、beads种类、洗涤条件 阅读提示：Methods, Immunoprecipitation (as described in figure legends) |
| 体外激酶实验 | 激酶来源、底物、ATP浓度、反应缓冲液、时间和温度 阅读提示：Methods, In Vitro Kinase Assay |
| 细胞增殖/存活检测 | 细胞数量、处理时间、检测方法（如结晶紫染色） 阅读提示：Results Section Loss of TBK1 Selectively Suppresses VHL Null ccRCC Cell Growth; Figure 3 |
| 软琼脂集落形成 | 琼脂浓度、细胞数量、培养时间、集落计数方法 阅读提示：Methods, Soft Agar Assay (presumably from supplementary); Figure 3C-D, 3L-M, 6K-L |
| 动物实验 | 小鼠品系（NSG）、细胞数量（5×10^5）、注射部位（肾包膜）、DOX食物给药时间及剂量、肿瘤成像时间点 阅读提示：Methods, Orthotopic Tumor Growth；Figure 4 |
| 免疫组化 | 组织处理、抗体浓度、抗原修复、评分标准 阅读提示：Methods (IHC presumably in supplementary); Figure 5 |
| 磷酸化蛋白质组学 | 细胞处理（CMPD1浓度、时间）、标记方法（TMT）、质谱条件、数据分析参数 阅读提示：Methods, Global quantitative phosphoproteomics analysis |