临床样本和细胞系中鉴定TRK xDFG突变
确定xDFG突变是否在临床和耐药细胞系中与下一代TRK抑制剂耐药相关。
对进展期患者肿瘤和cfDNA进行测序，并通过对细胞系慢性暴露于repotrectinib诱导耐药。
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TRK xDFG突变触发从I型到II型激酶抑制剂的敏感性转换
TRK xDFG Mutations Trigger a Sensitivity Switch from Type I to II Kinase Inhibitors
实验完整度
高包含临床样本测序、分子动力学模拟、体外激酶实验、细胞模型、动物模型和PDX等多层级验证，且包含功能与机制验证。
主要模型
TRK融合阳性癌症患者 Bcan-Ntrk1小鼠胶质瘤细胞 LMNA-NTRK1结直肠癌细胞系 患者来源异种移植模型
重点核对
TRKA G667C和G667A突变的等位基因频率 selitrectinib和repotrectinib对xDFG突变激酶的IC50值 II型抑制剂对xDFG突变激酶的IC50值 cabozantinib在体内模型中的给药剂量和频率
摘要
针对下一代TRK抑制剂在TRK融合阳性癌症中的靶向耐药性在很大程度上尚未被表征。在这些肿瘤患者中，我们发现TRK xDFG突变赋予了对设计用于维持对多种激酶结构域突变效力的下一代I型TRK抑制剂的耐药性。计算模型和生化实验表明，TRKA G667和TRKC G696 xDFG替换通过产生空间位阻减少药物结合。同时，这些突变稳定了激酶的非活性（DFG-out）构象，从而使这些激酶对II型TRK抑制剂敏感。一致地，II型抑制剂抑制xDFG突变同基因和患者来源模型的生长和TRK介导的信号传导。总的来说，这些数据表明适应性构象耐药可以通过改变激酶结合模式来消除。鉴于先前在其他癌基因依赖癌症中鉴定出旁系同源xDFG耐药突变，这些发现为利用抑制剂类别亲和力转换来应对难治性耐药改变提供了合理设计II型药物的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRK xDFG突变如何介导对下一代I型TRK抑制剂的耐药，以及这些突变是否影响对II型抑制剂的敏感性。
- 核心机制
- TRK xDFG替换（如G667C）通过空间位阻损害I型抑制剂结合，同时稳定非活性DFG-out构象，从而增强II型抑制剂结合。
- 主要证据
- 临床患者测序发现xDFG突变，分子动力学显示空间冲突和DFG-out稳定，体外激酶实验显示I型抑制剂IC50升高但II型抑制剂IC50降低，细胞和动物模型证实II型抑制剂有效。
- 研究意义
- xDFG突变可能作为II型TRK抑制剂敏感性的生物标志物，并为理性设计选择性II型激酶抑制剂提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分子建模和动力学模拟分析突变对药物结合的影响
探究xDFG替换影响I型抑制剂结合和稳定DFG-out构象的结构机制。
对TRKA WT和突变体与6种药物进行分子对接和MD模拟，分析空间冲突和构象稳定性。
体外激酶活性实验验证抑制剂敏感性
定量比较I型和II型抑制剂对TRKA、TRKC和ROS1 WT及突变体的抑制效力。
使用放射性体外激酶实验测定IC50值。
微尺度热泳实验测量结合亲和力
直接比较I型和II型抑制剂对TRKA G667C突变体的结合亲和力。
使用MST测定selitrectinib、cabozantinib和foretinib的Kd值。
同基因细胞模型验证抑制剂效果
在细胞水平验证xDFG突变对抑制剂敏感性的影响。
通过CRISPR-Cas9敲入突变，用CellTiter-Glo增殖实验和Western blot检测细胞活力和信号通路。
体内药效实验评估II型抑制剂抗肿瘤活性
评估cabozantinib对xDFG突变肿瘤的体内抗肿瘤效果。
将Bcan-Ntrk1、Trka G670C细胞颅内注射入NSG小鼠，用MRI监测肿瘤生长和生存期。
患者来源模型验证II型抑制剂克服耐药
在耐药患者来源模型中验证II型抑制剂的疗效。
使用对repotrectinib耐药的CRC细胞系、异种移植瘤和PDX模型，评估cabozantinib等对肿瘤生长的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物处理 | 拉罗替尼 | Loxo Oncology | -- |
| 塞尔替尼 | Loxo Oncology | -- | |
| 瑞普替尼 | Selleckchem | -- | |
| 卡博替尼 | MedChem Express | -- | |
| 福瑞替尼 | MedChem Express | -- | |
| 普纳替尼 | MedChem Express | -- | |
| 克唑替尼 | MedChem Express | -- | |
| 阿昔替尼 | MedChem Express | -- | |
| 体外激酶实验 | 星形孢菌素 | -- | -- |
| 细胞培养 | Neurocult干细胞基础培养基及增殖补充剂 | Stem Cell Technologies | -- |
| CRISPR | Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | -- |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA-ATTO-550 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| Alt-R S.p. Cas9核酸酶V3 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 细胞培养 | Amaxa SF细胞系核转染X试剂盒S | Lonza | -- |
| PCR | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | -- | |
| Western blot | pan Trk抗体 | Cell Signaling Technology | 92991S |
| 磷酸化TrkA (Y674/675)抗体 | Cell Signaling Technology | 4621S | |
| 磷酸化MEK1/2 (S217/221)抗体 | Cell Signaling Technology | 9154S | |
| MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9122L | |
| 磷酸化p44/42 MAPK (Erk1/2; T202/Y204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 磷酸化Met (Tyr1234/1235)抗体 | Cell Signaling Technology | 3129S | |
| MET抗体 | Cell Signaling Technology | 8198S | |
| V5抗体 | GeneScripts | A00623-100 | |
| 磷酸化酪氨酸抗体 | Millipore | 05-1050X | |
| ROS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3266S | |
| 磷酸化ROS1 (Tyr2274)抗体 | Cell Signaling Technology | 3078S | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970S | |
| 动物实验 | Bruker 4.7T Biospec扫描仪 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本测序 | 患者样本类型、测序平台、突变检测阈值 阅读提示：Methods: Patients, Targeted Tumor Sequencing, Targeted Plasma Sequencing |
| 分子建模 | 蛋白结构来源、突变构建方法、MD模拟参数 阅读提示：Methods: Structure Preparation, MD Simulations |
| 体外激酶实验 | 激酶浓度、ATP浓度、药物浓度范围、重复次数 阅读提示：Methods: In vitro Kinase Assays |
| 细胞增殖实验 | 细胞系、接种密度、药物处理浓度和时间、检测方法 阅读提示：Methods: Drug Screenings |
| 体内实验 | 动物品系、细胞注射量、给药剂量和频率、肿瘤测量方法 阅读提示：Methods: Intracranial Injection, Xenografts and PDX Studies |