转录组剪接分析
表征T-ALL与正常T细胞相比的剪接变化，特别是外显子跳跃。
对T-ALL患者样本和正常T细胞亚群进行RNA-seq，使用rMATS等工具分析差异性剪接事件。
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外显子跳跃机器的翻译后调控控制白血病中的异常剪接
Posttranslational Regulation of the Exon Skipping Machinery Controls Aberrant Splicing in Leukemia
实验完整度
高包含患者样本、细胞系、异种移植模型和多种组学数据等多层级证据，并有功能验证和机制验证。
主要模型
T-ALL细胞系（CUTLL1、JURKAT、DND41） T-ALL患者样本 免疫缺陷小鼠异种移植模型
重点核对
T-ALL细胞系和患者样本的SRSF6表达水平与USP7的相关性 USP7抑制（P5091）或敲低对SRSF6蛋白水平的影响 SRSF6敲低对细胞增殖和凋亡的影响 H3B-8800对T-ALL细胞系和患者样本的IC50值 H3B-8800与蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）的协同效应
摘要
剪接改变在疾病中很常见，例如癌症，其中剪接因子基因的突变经常是异常剪接的原因。在这里，我们提出了T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中剪接调控的另一种机制，该机制涉及通过去泛素化对剪接机器进行翻译后稳定化。我们证明，疾病中存在广泛的外显子跳跃改变，影响蛋白酶体亚基、细胞周期调节因子和RNA机器。我们提出，富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子（SRSF）控制外显子跳跃，对白血病细胞存活至关重要。泛素特异性肽酶7（USP7）通过主动去泛素化调节SRSF6蛋白水平，USP7抑制改变外显子跳跃模式并阻断T-ALL生长。剪接抑制剂H3B-8800影响蛋白酶体转录本的剪接和蛋白酶体活性，并与蛋白酶体抑制剂协同抑制T-ALL生长。我们的研究为通过去泛素化调节剪接因子提供了原理证明，并提出了T-ALL中新的治疗模式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在无剪接因子突变的T-ALL中，异常剪接是如何发生的，以及其分子机制和治疗意义是什么？
- 核心机制
- USP7通过去泛素化作用稳定SRSF6蛋白，导致外显子跳跃变化，促进T-ALL生长。
- 主要证据
- USP7与SRSF6相互作用并去泛素化SRSF6；USP7抑制或敲低降低SRSF6水平；SRSF6敲低抑制T-ALL细胞系和异种移植模型中的生长。
- 研究意义
- 为通过去泛素化调控剪接因子提供原理证明，并提出剪接抑制剂与蛋白酶体抑制剂联合治疗T-ALL的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SRSF功能筛选
鉴定对T-ALL存活关键的SRSF家族成员。
利用DepMap CRISPR-Cas9筛选数据和在JURKAT细胞中进行定制RBP sgRNA文库的负筛选。
USP7-SRSF6相互作用和去泛素化验证
验证USP7通过去泛素化调控SRSF6蛋白稳定性的机制。
通过免疫共沉淀、质谱、泛素化实验（KGG pull-down和Flag-SRSF6泛素化检测）以及蛋白合成抑制剂实验。
SRSF6功能研究
评估SRSF6对T-ALL细胞生长的影响。
在CUTLL1细胞中敲低SRSF6，进行体外生长实验和异种移植模型实验。
剪接抑制治疗评估
评估剪接抑制剂H3B-8800对T-ALL的治疗效果及与蛋白酶体抑制剂的协同作用。
用H3B-8800处理T-ALL细胞系和患者样本，检测生长抑制、凋亡、剪接变化和蛋白酶体活性。
PSMG1剪接和蛋白酶体功能
确定剪接抑制对蛋白酶体亚基PSMG1剪接的影响及其功能后果。
RNA-seq分析PSMG1剪接变化，RT-PCR验证外显子4跳跃，检测蛋白酶体活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
转录组测序和剪接分析
蛋白质相互作用和翻译后修饰分析
体内实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| GlutaMAX | Gibco | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Western blot | 抗肌动蛋白抗体 | Millipore | -- |
| 抗SRSF6抗体 | Bethyl Laboratories | A303-669A | |
| 抗SRSF6抗体 | Abcam | ab140602 | |
| 抗SRSF3抗体 | Abcam | ab73891 | |
| 抗SF3B1抗体 | MLB | D221-3 | |
| 抗USP7抗体 | Bethyl Laboratories | A300-033A-7 | |
| 抗切割NOTCH1（Val1744）抗体 | Cell Signaling Technology | 4147 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Proteintech Group | 12987-1-AP | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| HRP偶联二抗 | GE Healthcare | -- | |
| 蛋白质定量 | Quick Start牛γ球蛋白标准品套装 | Bio-Rad | -- |
| 分子生物学 | 苯zonase核酸酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 核糖核酸酶A | Sigma-Aldrich | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 正钒酸钠 | New England BioLabs | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白G磁珠 | Life Technologies | -- |
| 分子生物学 | 无IgG牛血清白蛋白 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | -- |
| 蛋白酶K | Fisher Scientific | -- | |
| 细胞固定 | Tousimis甲醛 | Fisher Scientific | -- |
| 蛋白质抑制 | MG132 | Fisher Scientific | -- |
| 药物处理 | P5091 | Selleckchem | -- |
| H3B-8800 | H3 Biomedicine | -- | |
| 蛋白质组学 | PTMScan泛素残留基序（K-GG）试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| RNA提取 | Bio-Rad总RNA提取试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| RNA测序文库构建 | TruSeq RNA试剂盒 | Illumina | -- |
| AMPure XP磁珠 | -- | -- | |
| 转染 | jetPrime转染试剂 | Polyplus | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 细胞活性检测 | alamarBlue细胞活性试剂 | ThermoFisher | -- |
| 细胞凋亡检测 | LIVE/DEAD可固定近红外死细胞染料 | Life Technologies | -- |
| PE偶联Annexin V | Life Technologies | -- | |
| Annexin V结合缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞周期分析 | 固定和通透培养基A | Life Technologies | -- |
| DAPI | Invitrogen | -- | |
| 药物处理 | 硼替佐米 | -- | -- |
| 卡非佐米 | -- | -- | |
| 细胞计数 | Via Count试剂盒 | Luminex | -- |
| 蛋白酶体活性检测 | 胰凝乳蛋白酶样活性检测试剂盒 | Promega | G8660 |
| 细胞增殖检测 | MTT | -- | -- |
| 流式细胞术 | 人CD45抗体 | -- | -- |
| 人CD7抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | T-ALL细胞系（CUTLL1、JURKAT、DND41）的培养基成分（RPMI 1640 + 10% FBS + 2% 青霉素/链霉素 + 1% GlutaMAX） 阅读提示：Methods: Cell lines and primary cells |
| USP7抑制实验 | USP7抑制剂P5091浓度（文中使用10μM）和处理时间（24小时） 阅读提示：Results: USP7调控SRSF6，Figure 2L |
| 蛋白稳定性分析 | 环己酰亚胺（CHX）浓度（200μg/ml）和处理时间（0-24小时） 阅读提示：Results: USP7调控SRSF6，Figure 2N |
| 剪接抑制实验 | H3B-8800浓度（例如30nM）和处理时间（6小时或72小时） 阅读提示：Results: 治疗性剪接抑制，Figure 4A, 4E |
| 异种移植实验 | 小鼠品系（NOD.Cg-Prkdcscid）、注射细胞数量（1x10^6）、注射途径（尾静脉） 阅读提示：Methods: 静脉内和皮下异种移植研究 |