鉴定钙内流调控的circRNAs
利用NGS筛选钙内流调控的circRNAs，并通过RT-PCR验证候选circRNAs的表达变化。
Jurkat细胞用离子霉素（1 μg/mL）处理1小时，RNA经RNase R消化后测序，鉴定差异表达circRNAs，并用RT-PCR验证。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
钙内流调控的Circ-CAMTA1抑制丙酮酸羧化酶活性并调节系统性红斑狼疮患者的T细胞功能
Circ-CAMTA1 regulated by Ca2+ influx inhibited pyruvate carboxylase activity and modulate T cell function in patients with systemic lupus erythematosus
实验完整度
高包含细胞系实验、临床样本分析（42例患者和23例对照）、功能验证（转染、RNA pull-down、酶活性、葡萄糖和IL-2检测）及关联性分析。
主要模型
Jurkat细胞系 SLE患者T细胞 健康对照T细胞
重点核对
离子霉素（1 μg/mL）处理Jurkat细胞1小时诱导钙内流 SLE患者与健康对照T细胞中circ-CAMTA1、circ-ASH1L表达水平与疾病活动度（SLEDAI-2K）的关联 IFN-α（1000 IU/mL）处理Jurkat细胞72小时对circ-CAMTA1表达的影响 转染circ-CAMTA1后对丙酮酸羧化酶活性、细胞外葡萄糖和IL-2分泌的影响
摘要
目的：探讨钙内流调控的环状RNA（circRNAs）在系统性红斑狼疮（SLE）患者T细胞中的作用。方法：通过下一代测序分析共培养或不共培养离子霉素的Jurkat细胞中circRNAs的表达谱，并使用实时聚合酶链反应进行验证。进一步在42名SLE患者和23名健康对照的T细胞中检测鉴定出的钙内流调控的circRNAs。通过转染和RNA pull-down实验研究特定circRNA的生物学功能。结果：经过验证，我们确认circ-ERCC4、circ-NFATC2、circ-MYH10、circ-CAMTA1、circ-ASH1L、circ-SOCS7和circ-ASAP1的表达水平在钙内流后的Jurkat细胞中持续升高。SLE患者T细胞中circ-CAMTA1、circ-ASH1L和circ-ASAP1的表达水平显著降低，在疾病活动度较高的患者中观察到更低水平。干扰素（IFN）-α被发现抑制circ-CAMTA1的表达。Circ-CAMTA1与丙酮酸羧化酶结合并抑制其生物活性。过表达circ-CAMTA1而非其线性形式，显著降低细胞外葡萄糖水平。此外，circ-CAMTA1表达增加而非其线性形式，降低了miR-181c-5p的表达，导致IL-2分泌增加。结论：三种钙内流调控的circRNAs——circ-CAMTA1、circ-ASH1L和circ-ASAP1——在SLE患者的T细胞中显著减少，并与疾病活动度相关。IFN-α抑制circ-CAMTA1的表达，circ-CAMTA1与丙酮酸羧化酶相互作用，抑制其活性，影响葡萄糖代谢，并增加IL-2分泌。这些发现表明，受钙内流调控的circ-CAMTA1调节了SLE患者的T细胞功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 钙内流是否调节T细胞中circRNAs的表达，这些circRNAs是否与SLE的T细胞功能障碍相关？
- 核心机制
- Circ-CAMTA1通过结合并抑制丙酮酸羧化酶活性，减少葡萄糖生成，并下调miR-181c-5p表达，进而增加IL-2分泌；IFN-α可能通过抑制circ-CAMTA1表达导致SLE T细胞IL-2分泌减少。
- 主要证据
- NGS和RT-PCR鉴定了7种钙内流上调的circRNAs，其中circ-CAMTA1在SLE患者T细胞中表达降低；RNA pull-down和RIP证实circ-CAMTA1与丙酮酸羧化酶结合；过表达circ-CAMTA1降低细胞外葡萄糖和miR-181c-5p水平并增加IL-2分泌。
- 研究意义
- circ-CAMTA1可能作为SLE疾病活动度的生物标志物，并可能为SLE的诊断和疾病监测提供潜在用途，但其在糖异生和SLE治疗中的意义需要进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证临床样本中circRNAs的表达
评估鉴定的circRNAs在SLE患者和健康对照T细胞中的表达水平，并分析与疾病活动度的关联。
从SLE患者和健康对照外周血分离T细胞，提取RNA检测circRNAs表达，并用回归分析关联临床参数。
研究circ-CAMTA1与丙酮酸羧化酶的相互作用
确定circ-CAMTA1是否与丙酮酸羧化酶结合并影响其活性。
通过RNA pull-down和RIP验证相互作用，通过转染circ-CAMTA1检测丙酮酸羧化酶活性。
功能研究circ-CAMTA1对T细胞功能的影响
评估circ-CAMTA1对IL-2分泌、细胞增殖、激活和miR-181c-5p表达的影响。
转染circ-CAMTA1后，用PMA和离子霉素刺激Jurkat细胞，通过ELISA检测IL-2分泌，流式检测CD25，WST-1检测增殖，RT-PCR检测miR-181c-5p。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证蛋白与RNA相互作用
检测蛋白表达和活性
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Jurkat细胞 | American Type Culture Collection | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| PMA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 重组人IFN-α | Proteintech | -- | |
| 细胞培养 | TRIZOL试剂盒 | Invitrogen | -- |
| RNA处理 | RNase R | Epicentre | -- |
| RNA测序 | RiboMinus试剂盒 | KAPA | -- |
| 生物分析仪2100 | Agilent Technology | -- | |
| SureSelect XT HS2 mRNA文库制备试剂盒 | Agilent | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Illumina边合成边测序技术 | Illumina | -- | |
| 细胞裂解和核提取 | NP-40 | Sigma-Aldrich | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 核提取 | 核提取试剂盒 | Active Motif | -- |
| 转染 | 编码circ-CAMTA1的pcDNA3.1(+) CircRNA Mini Vector | Addgene | -- |
| circ-CAMTA1线性形式的pcDNA3.1载体 | Addgene | -- | |
| RNA pull-down | T7 RNA聚合酶 | Ambion Inc. | -- |
| 生物素RNA标记试剂盒 | Roche | -- | |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 链霉亲和素偶联的Dynabeads | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 银染试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质鉴定 | NanoLC-MS/MS QSTAR XL系统 | Applied Biosystems | -- |
| Western blot | 抗NFAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 4389 |
| 抗PKR抗体 | Cell Signaling Technology | 12297 | |
| 抗lamin A/C抗体 | Taiclone | tcba178 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 免疫沉淀 | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| RNA提取 | RNA Clean & Concentrator-5试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 酶联免疫吸附 | ELISA试剂盒 | BD Biosciences | -- |
| 蛋白纯化 | Ni2+-Sepharose色谱 | -- | -- |
| Sephacryl-200 | -- | -- | |
| 葡萄糖检测 | 葡萄糖检测试剂盒 | Abcam | -- |
| RNA提取 | Quick-RNA MiniPrep试剂盒 | Zymo Research | -- |
| RT-PCR | 一步法RT-PCR试剂盒 | TaKaRa | -- |
| ABI Prism 7500 Fast实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式细胞术 | 抗人CD25 FITC | Becton Dickinson | 565096 |
| FITC小鼠IgG1同型对照 | Becton Dickinson | 555748 | |
| FACSMelody | Becton Dickinson | -- | |
| 细胞增殖 | WST-1 | Roche Diagnostics | -- |
| SpectraMax iD5多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和刺激 | Jurkat细胞培养条件，离子霉素浓度（1 μg/mL）和处理时间（1小时）；PMA和离子霉素浓度（20 ng/mL和500 ng/mL）及处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods, Cell culture |
| 患者样本和T细胞分离 | SLE患者诊断标准（ACR 1997或SLICC 2012），疾病活动度评估（SLEDAI-2K），T细胞分离方法（anti-human CD3磁珠，IMag系统），药物洗脱时间（至少12小时） 阅读提示：Materials and methods, Patients and controls, Isolation of RNA from T cells |
| circRNA表达检测 | RNA提取方法（TRIZOL），RNase R处理时间（30分钟），RT-PCR引物设计（跨越back-splice junction），内参（GAPDH） 阅读提示：Materials and methods, Isolation of RNA from T cells, Measurement of RNA expression levels by RT-PCR |
| circ-CAMTA1功能实验 | 转染方法（电穿孔），质粒（pcDNA3.1 circ-CAMTA1或线性形式），刺激条件（PMA 20 ng/mL + ionomycin 500 ng/mL, 48小时），检测指标（IL-2分泌、酶活性、葡萄糖水平） 阅读提示：Materials and methods, Transfection study, ELISA, Measurement of pyruvate carboxylase activity and glucose levels |
| 结合实验 | RNA pull-down实验中的生物素标记RNA浓度（0.5 μg），细胞提取物量（1.5 mg），孵育时间和温度（4°C，2小时），RIP实验中的抗体（抗PC）和磁珠量 阅读提示：Materials and methods, RNA pull-down assay, RNA immunoprecipitation |