检测滑膜组织中的肽聚糖
确定细菌肽聚糖(PG)是否存在于骨关节炎(OA)患者的滑膜组织中。
使用针对PG的定制小鼠抗血清,通过免疫组织化学(IHC)染色新鲜冷冻滑膜组织切片;使用免疫荧光显微镜(IFM)与巨噬细胞(CD68)和成纤维细胞(CD90)标志物共定位。阳性对照为假体周围感染患者的滑膜组织。
Peptidoglycan in osteoarthritis synovial tissue is associated with joint inflammation
含患者样本检测(IHC/IFM)、组织病理评分、原代细胞刺激实验及多因子检测,兼具体内外证据。
骨关节炎患者滑膜组织 滑膜液 原代人滑膜成纤维细胞 小鼠抗肽聚糖血清
患者队列:56例初次TKA,无感染史,年龄中位数67岁 滑膜组织PG检测:IHC和IFM,PG阳性标准为33/56(59%) 滑膜炎症评分:H&E染色,0-3分,三个分项求和 原代成纤维细胞刺激:10µg/ml MDP(来自金黄色葡萄球菌PG),24小时 细胞因子检测:LEGENDplex Human Inflammation Panel,13种细胞因子
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定细菌肽聚糖(PG)是否存在于骨关节炎(OA)患者的滑膜组织中。
使用针对PG的定制小鼠抗血清,通过免疫组织化学(IHC)染色新鲜冷冻滑膜组织切片;使用免疫荧光显微镜(IFM)与巨噬细胞(CD68)和成纤维细胞(CD90)标志物共定位。阳性对照为假体周围感染患者的滑膜组织。
评估滑膜组织炎症和纤维化程度,并探讨其与PG水平的相关性。
对滑膜组织切片进行H&E染色评估炎症,Masson三色染色评估纤维化,并采用盲法评分。
量化滑膜液中的炎症细胞因子水平,并分析与PG评分的相关性。
使用LEGENDplex Human Inflammation Panel(Biolegend)通过流式细胞术量化13种细胞因子/趋化因子。
确定PG是否直接诱导滑膜成纤维细胞产生炎症细胞因子。
从OA等患者的滑膜组织中分离原代成纤维细胞,用金黄色葡萄球菌PG的胞壁二肽(MDP)刺激,收集上清液进行多重细胞因子检测。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织染色 | 抗肽聚糖抗血清 | -- | -- |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Sigma-Aldrich | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗人CD90/Thy1抗体 | Origene | TA318808 |
| 兔抗人CD68 | Cell Signaling | 76437 | |
| DAPI | Sigma | -- | |
| AF488偶联抗小鼠IgG | Invitrogen | A10037 | |
| Cy3偶联抗兔IgG | Jackson Immuno | 715-166-152 | |
| AF647偶联抗山羊IgG | Invitrogen | A21447 | |
| 免疫荧光成像 | Olympus VS120玻片扫描仪 | Olympus | -- |
| 细胞培养 | 胶原酶D | Sigma Aldrich | 11088858001 |
| Hank's平衡盐溶液 | Sigma Aldrich | 55037C | |
| 青霉素/链霉素 | Fisher Scientific | 15140122 | |
| 高糖DMEM培养基 | Sigma Aldrich | D5671 | |
| 胎牛血清 | BioWest | S1690 | |
| 谷氨酰胺 | Fisher Scientific | 35050061 | |
| 非必需氨基酸 | Fisher Scientific | 11140050 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | BioLegend | 792504 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex人炎症因子检测试剂盒 | Biolegend | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列 | 患者来源、纳入标准(初次TKA、无感染史、无关节内注射)、样本量56例、人口统计学信息(年龄中位数67岁,BMI中位数31.5 kg/m2) 阅读提示:Methods-Patients,Table 1 |
| 滑膜组织PG检测 | PG评分标准(0-4级,基于10 mm2内PG计数)、阳性对照(PJI患者)、IHC和IFM方法细节、评分者盲法 阅读提示:Methods-PG staining and scoring,Methods-Immunofluorescence microscopy |
| 滑膜炎症和纤维化评分 | H&E染色炎症评分(0-3分,三个分项)、Masson三色染色纤维化评分(0-3分)、评分者盲法 阅读提示:Methods-Histopathology |
| 细胞因子检测 | 滑膜液样本收集、LEGENDplex Human Inflammation Panel使用流程、细胞因子种类(13种) 阅读提示:Methods-Cytokine analysis |
| 原代成纤维细胞分离与刺激 | 细胞来源(OA等)、分离方法(胶原酶D消化)、传代数(至少6次)、刺激条件(10 µg/ml MDP,24小时)、对照组设置(培养基对照) 阅读提示:Methods-Primary human fibroblast isolation and stimulation,Methods-Fibroblast stimulation |