长链非编码RNA IL21-AS1参与系统性红斑狼疮中白细胞介素-2和滤泡调节性T细胞活化

Involvement of lncRNA IL21-AS1 in interleukin-2 and T follicular regulatory cell activation in systemic lupus erythematosus

作者信息He Hao, Shingo Nakayamada, Naoaki Ohkubo, Kaoru Yamagata, Mingzeng Zhang, Yu Shan, Shigeru Iwata, Tong Zhang, Yoshiya Tanaka
PMID34895341
发布时间2021-12-11
DOI10.1186/s13075-021-02682-w

实验完整度

研究包含患者样本的基因分型、qPCR表达分析和流式细胞术,但缺乏功能实验和体内模型,实验层级较单一。

主要模型

SLE患者外周血单个核细胞(PBMC) CD4+ T细胞亚群 健康对照和类风湿关节炎患者样本

重点核对

rs62324212基因型频率在SLE、RA和健康对照中的分布 IL21-AS1在PBMC和CD4+ T细胞中的表达水平 IL21-AS1与IL2和IL21 mRNA表达的相关性 IL21-AS1与活化Tfr细胞比例和疾病活动度的相关性 CD4+ T细胞亚群的流式细胞术分析门控策略

摘要

背景:位于IL21反义RNA 1(IL21-AS1)中的单核苷酸多态性(SNP)rs62324212已被确定为与系统性红斑狼疮(SLE)相关的遗传风险变异。我们旨在探讨IL21-AS1的特征,并重点关注SLE患者中T辅助细胞亚群和疾病活动度,探索其临床相关性。方法:使用定量PCR的等位基因区分法进行rs62324212基因分型。使用PCR和流式细胞术分析外周血单核细胞中的基因表达和CD4+ T细胞的细胞表面标志物。评估IL21-AS1、CD4+ T细胞亚群与SLE疾病活动度之间的关联。结果:Ensembl基因组浏览器分析显示,rs62324212(C>A)位于IL21-AS1的预测增强子区域。IL21-AS1在CD4+ T细胞和B细胞的细胞核中表达,但在SLE患者中表达降低。IL21-AS1表达与IL-2的mRNA水平呈正相关,但与IL-21无关,并且与活化滤泡调节性T(Tfr)细胞的比例相关。此外,我们观察到IL21-AS1表达与SLE患者的疾病活动度呈显著负相关(n=53,p<0.05)。结论:IL21-AS1通过参与IL-2介导的Tfr细胞活化对SLE疾病活动度产生影响。因此,靶向IL21-AS1可能为SLE提供治疗方法。补充信息:在线版本包含补充材料,可在10.1186/s13075-021-02682-w处获取。关键词:系统性红斑狼疮,淋巴细胞,T细胞,分子生物学,细胞因子,炎症介质。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
IL21-AS1在系统性红斑狼疮中的表达特征及其与IL-2、T滤泡调节性细胞和疾病活动度的关系。
核心机制
IL21-AS1可能通过调控IL-2的表达参与Tfr细胞的活化,从而影响SLE疾病活动度。
主要证据
SLE患者PBMC中IL21-AS1表达降低,且与IL-2水平及活化Tfr细胞比例正相关,与SLEDAI评分负相关。
研究意义
IL21-AS1可能作为SLE的治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

SNP基因分型与定位

确定rs62324212在SLE中的等位基因频率及其在基因组中的位置。

使用TaqMan SNP genotyping对患者和健康对照进行基因分型,并通过Ensembl和HaploReg分析SNP位置和染色质状态。

2

IL21-AS1表达分析

检测IL21-AS1在不同细胞类型中的表达水平及其在SLE中的变化。

从PBMC中分离CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、B细胞和单核细胞,提取RNA,通过qPCR检测IL21-AS1表达,并比较SLE、RA和健康对照组。

3

亚细胞定位分析

确定IL21-AS1在细胞内的定位。

从Jurkat和BJAB细胞中分离细胞质和细胞核RNA,通过qPCR检测IL21-AS1和NEAT1的表达。

4

相关性分析

评估IL21-AS1与细胞因子和T细胞亚群的关系。

在SLE患者PBMC中检测IL21-AS1、IL2、IL21的mRNA水平,通过流式细胞术鉴定Tfh、Tfr、Tph等亚群,并进行相关性分析。

5

与疾病活动度的关联

探讨IL21-AS1表达与SLE疾病活动度的关系。

分析IL21-AS1表达与SLEDAI、BILAG评分以及血清标志物的相关性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
淋巴细胞分离液Cedarlane Corporation--
抗CD4-V500抗体BD Biosciences560769
抗CD8-PE-Cy5.5抗体BD Biosciences555368
抗CD14-PE抗体BD Biosciences555398
抗CD19-FITC抗体BD Biosciences302206
抗CD3-V450抗体BD Biosciences560366
抗CD45RA-PE-Cy7抗体BD Biosciences560675
抗CXCR5-APC抗体BioLegend356907
抗PD-1-PE-Cy7抗体BD Biosciences561272
抗Foxp3-Alexa Fluor 488抗体BD Biosciences560047
转录因子缓冲液BD Biosciences--
透化/洗涤缓冲液BD Biosciences--
BD FACSLyric流式细胞仪BD Biosciences--
FlowJo v10软件TOMY Digital Biology--
RNeasy Mini试剂盒Qiagen--
细胞质和细胞核RNA纯化试剂盒Norgen--
High Capacity RNA逆转录试剂盒Applied Biosystems--
IL21-AS1探针 (Hs04976181_s1)Applied BiosystemsHs04976181_s1
IFNG-AS1探针 (Hs04408308_m1)Applied BiosystemsHs04408308_m1
NEAT1探针 (Hs03453535_s1)Applied BiosystemsHs03453535_s1
IL2探针 (Hs00174114_m1)Applied BiosystemsHs00174114_m1
IL21探针 (Hs00222327_m1)Applied BiosystemsHs00222327_m1
GAPDH探针 (Hs99999905_m1)Applied BiosystemsHs99999905_m1
Quick-DNA Mini制备试剂盒Zymo ResearchD3024
NanoDrop分光光度计NanoDrop Technologies--
TaqMan SNP基因分型探针Thermo Fisher4351379
TaqMan通用PCR预混液Thermo Fisher Scientific4324018
GraphPad Prism v8软件Prism Software--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者队列
SLE患者、RA患者和健康对照的入组标准、样本量、性别比例、年龄、疾病活动度评分(SLEDAI、BILAG)
阅读提示:Patients 部分和Table 1
基因分型
rs62324212基因分型方法(TaqMan探针)、PCR条件、内参
阅读提示:Genotyping of SNPs 部分
基因表达分析
RNA提取方法、qPCR引物/探针序列、内参基因(GAPDH)、相对定量方法
阅读提示:Quantitative real-time PCR 部分
流式细胞术
细胞表面标志物、抗体克隆号、染色条件、门控策略、细胞亚群定义
阅读提示:Flow cytometry 部分和Fig. 3B
相关性分析
使用的统计方法、变量、样本量
阅读提示:Statistical analysis 部分和Results