单细胞转录组数据分析
识别瘢痕疙瘩中成纤维细胞和施万细胞的亚群及相互作用。
整合4个公开数据集共29个样本的scRNA-seq数据，经过质量控制、整合、聚类，识别8种主要细胞类型，并对成纤维细胞和施万细胞进行亚群分析。
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单细胞解析瘙痒性瘢痕疙瘩：成纤维细胞与施万细胞通过Midkine信号的相互作用
Single cell deciphering of pruritic keloids: the interaction between fibroblasts and Schwann cells through the Midkine signaling
实验完整度
高整合多数据集scRNA-seq分析，结合临床样本免疫荧光、原代细胞培养、qRT-PCR、Western blot、ELISA、DRG共培养及小鼠瘢痕模型验证，包含功能与机制验证。
主要模型
瘢痕疙瘩患者组织样本 瘢痕疙瘩原代成纤维细胞 施万细胞系（IMMOCELL） 小鼠皮肤瘢痕模型（C57BL/6）
重点核对
scRNA-seq数据来源（GSE163973、GSE181297、GSE181316、HRA000425）及质量控制参数 MDK处理浓度（5 ng/ml或10 ng/ml）及处理时间（24 h） iMDK给药剂量（9 mg/kg，皮下注射，每48 h一次）及给药时长 DRG神经元与施万细胞共培养的时间（72 h）及检测指标（神经突面积） 临床患者纳入和排除标准及瘙痒疼痛评分（12-PSS、DN4）
摘要
背景：瘢痕疙瘩是一种常见的皮肤纤维增生性疾病，可导致严重的美观和功能问题。瘙痒和疼痛是瘢痕疙瘩最常见的临床表现。瘢痕疙瘩内的施万细胞（SCs）变异和神经病变导致了这些不适感觉，但其潜在机制仍不清楚。本研究旨在探讨成纤维细胞（FBs）和SCs在瘙痒性和疼痛性瘢痕疙瘩中的潜在作用。方法：使用瘢痕疙瘩的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据研究FBs和SCs的活性。这些生物信息学分析结果通过体外细胞培养、临床样本和体内实验进行验证。所选分子被确认与疼痛和瘙痒相关，随后用于处理细胞以研究其在瘢痕疙瘩中的作用。进行体内抑制实验以评估其治疗潜力。结果：我们的scRNA-seq分析确定，在瘢痕疙瘩中，特定类型的FBs和SCs比例较高，并表现出神经发生相关功能。对这两种细胞类型进行交互分析后，我们确定了一个关键分子Midkine（MDK），它与患者的疼痛和瘙痒水平呈正相关。此外，MDK处理促进了SCs的增殖及其向修复表型的转变，导致神经元轴突发生。这种修复性SCs的激活促进了神经纤维释放P物质，导致瘢痕疙瘩患者出现疼痛和瘙痒的临床症状。靶向MDK可有效减少异常施万细胞增殖，并随后抑制引发疼痛和瘙痒的神经肽的分泌。结论：我们的研究揭示了FBs和SCs在瘢痕疙瘩疼痛和瘙痒发展中的相互作用，为减轻瘢痕疙瘩的痛苦症状提供了一种新的治疗策略。关键词：单细胞转录组，瘢痕疙瘩，成纤维细胞，施万细胞，神经发生
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 瘢痕疙瘩中成纤维细胞和施万细胞如何相互作用，从而导致疼痛和瘙痒？
- 核心机制
- ASPN+成纤维细胞分泌MDK，激活施万细胞增殖并向修复表型转化，促进神经轴突生长，进而诱导神经纤维释放P物质，引起疼痛和瘙痒。
- 主要证据
- scRNA-seq揭示ASPN+ FB和IGFBP5+ SC亚群在瘢痕疙瘩中富集且相互作用增强，MDK表达与临床疼痛瘙痒评分正相关；体外实验证实MDK促进施万细胞增殖和修复表型，DRG共培养显示轴突生长增加；小鼠模型中iMDK抑制施万细胞亚群并减少P物质分泌。
- 研究意义
- 本研究首次阐明FB-SC相互作用在瘢痕疙瘩疼痛和瘙痒中的机制，提出MDK可作为缓解瘢痕疙瘩相关症状的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞亚群功能分析
探究瘢痕疙瘩中ASPN+ FB和IGFBP5+ SC亚群的生物学功能。
对FB-C0和SC-Keloid亚群进行GO、Reactome和GSEA富集分析，并利用免疫荧光评估ASPN+ FB与神经纤维及IGFBP5+ SC的空间关系。
细胞通讯分析
鉴定ASPN+ FB和施万细胞之间的关键相互作用分子。
使用CellChat分析ASPN+ FB与各SC亚群的相互作用，筛选出MDK作为关键信号分子，并验证其受体表达。
临床样本验证
验证MDK在瘢痕疙瘩中的表达及其与患者瘙痒疼痛的相关性。
通过qRT-PCR和ELISA检测原代成纤维细胞中MDK表达，通过免疫荧光染色评估MDK水平，并与12-PSS和DN4评分进行相关性分析。
体外功能实验
评估MDK对施万细胞增殖、表型转化及神经突生长的影响。
用MDK处理施万细胞，通过EdU、CCK-8、流式细胞术检测增殖，Western blot和qRT-PCR检测修复表型标志物，DRG共培养检测轴突生长。
体内抑制实验
评估MDK抑制剂在瘢痕疙瘩相关疼痛和瘙痒中的治疗潜力。
建立小鼠皮肤瘢痕模型，给予MDK抑制剂iMDK或PBS，通过免疫荧光检测IGFBP5+ SC和SP+神经纤维的变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 完全培养基 | IMMOCELL | IMP-M118-1 | |
| 药物处理 | MDK（中期因子） | MedChemExpress | HY-P700223AF |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dajindo | -- |
| EdU DNA细胞增殖检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Solarbio | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT预混液 | Takara | RR036A |
| qRT-PCR | SYBR预混液 | Takara | RR066A |
| ABI QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Roche | -- | |
| Western blot | PVDF膜 | Merck-Millipore | -- |
| ECL化学发光检测试剂 | Millipore | -- | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| p75NTR抗体 | Proteintech | 55014-1-AP | |
| NCAM1抗体 | Proteintech | 14255-1-AP | |
| 免疫荧光 | βIII微管蛋白抗体 | Abcam | ab78078 |
| αSMA抗体 | Abcam | ab32575, ab7817 | |
| PGP9.5抗体 | Abcam | ab8189 | |
| ASPN抗体 | Affinity | DF13642 | |
| MDK抗体 | Proteintech | 11009-1-AP | |
| S100B抗体 | Abcam | ab52642 | |
| TAC1抗体 | Proteintech | 13839-1-AP | |
| IGFBP5抗体 | Proteintech | 55205-1-AP | |
| 细胞周期分析 | 细胞周期检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| ELISA | 人Midkine ELISA试剂盒 | Boster Biological Technology | -- |
| 分离试剂 | 中性蛋白酶II | Gibco | 17105041 |
| 胶原酶NB4 | Nordmark | S1745401 | |
| DRG神经元分离 | DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 |
| I型胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T8003 | |
| IA型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| DRG神经元共培养 | Neurobasal培养基 | Gibco | 21103049 |
| B-27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | |
| 免疫荧光 | DAPI | Sigma-Aldrich | -- |
| 图像采集 | 共聚焦显微镜系统 | Leica | TSC SP8 |
| 体内实验 | iMDK（MDK抑制剂） | MCE | HY-110171A |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| scRNA-seq数据整合与聚类 | 数据来源（GSE163973、GSE181297、GSE181316、HRA000425），样本数量（6正常皮肤、6正常瘢痕、4瘢痕疙瘩邻近皮肤、13瘢痕疙瘩），质量控制参数，高变基因数量，聚类分辨率 阅读提示：Methods中Single cell RNA-seq data acquisition和scRNA-seq data analysis部分 |
| 细胞培养 | 原代成纤维细胞分离方法（dispase II和collagenase NB4浓度、消化时间），施万细胞系来源（IMMOCELL）及培养基，培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods中Cell culture部分 |
| MDK处理 | MDK浓度（5 ng/ml或10 ng/ml），处理时间（24 h），对照组（DMSO） 阅读提示：Methods中Cell culture部分 |
| DRG神经元共培养 | 小鼠周龄（8周），酶消化液组成（DNase I、trypsin type I、collagenase type IA）及消化时间（30 min），共培养时间（72 h），检测指标（平均神经突面积） 阅读提示：Methods中Mouse DRG neuron isolation and co-culture assay部分 |
| 体内小鼠瘢痕模型 | 小鼠品系（C57BL/6），伤口直径（5 mm），iMDK剂量（9 mg/kg）及给药方式（皮下注射，每48 h），取材时间（术后14天） 阅读提示：Methods中Murine cutaneous scarring model部分 |
| 临床样本评估 | 患者纳入排除标准，评估工具（12-PSS、DN4），样本量（21例），MDK免疫荧光强度与评分相关性 阅读提示：Methods中Clinical samples and ethics statement部分和结果部分 |