基于自喂养三维培养的毛乳头细胞来源细胞外囊泡通过Krüppel样因子4/血管内皮生长因子A驱动的血管生成促进伤口愈合

背景：难以愈合的伤口是临床上重要的难题。已有证据表明，毛乳头细胞（DPCs）可能通过分泌细胞外囊泡（EVs）来调节伤口愈合过程。然而，低分离效率和受限的细胞活性阻碍了DPC-EVs在伤口愈合中的应用。本研究旨在基于自喂养三维（3D）培养开发新型3D-DPC球体（tdDPCs），并评估tdDPC-EVs在刺激血管生成和皮肤伤口愈合中的作用。方法：为解决当前DPC-EVs的局限性，我们先前开发了一种自喂养3D培养方法构建tdDPCs。通过免疫荧光染色和流式细胞术鉴定DPCs和tdDPCs。随后，我们从细胞中提取EVs，并通过免疫荧光染色、划痕实验和Transwell实验比较DPC-EVs和tdDPC-EVs对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的体外作用。同时，我们建立了小鼠全层皮肤损伤模型，并使用激光多普勒以及苏木精-伊红（H&E）、Masson、CD31和α-SMA染色评估了DPC-EVs和tdDPC-EVs对体内伤口愈合效率的影响。为阐明潜在机制，我们对tdDPC-EVs和磷酸盐缓冲液（PBS）处理的HUVECs进行了RNA测序（RNA-seq）。为验证RNA-seq数据，我们构建了Krüppel样因子4（KLF4）的敲低和过表达载体。通过Western blotting、划痕实验、Transwell实验和管形成实验检测了KLF4和血管内皮生长因子A（VEGFA）在KLF4敲低或过表达后tdDPC-EVs处理的HUVECs中的蛋白表达、细胞迁移和管腔形成能力。进行了双荧光素酶报告基因实验以验证KLF4对VEGFA的激活作用。结果：我们成功培养了tdDPCs并从DPCs和tdDPCs中提取了EVs。tdDPC-EVs显著促进HUVECs的增殖、管腔形成和迁移。与DPC-EVs不同，tdDPC-EVs在促进血管生成、加速伤口愈合和提高伤口愈合效率方面在体外和体内均显示出显著优势。生物信息学分析和进一步的功能实验证实，tdDPC-EVs调控的KLF4/VEGFA轴在加速伤口愈合中起关键作用。结论：3D培养可作为创新优化策略，有效开发用于治疗皮肤伤口的DPC来源EVs。tdDPC-EVs通过KLF4/VEGFA驱动的血管生成显著促进伤口愈合。关键词：细胞外囊泡，毛乳头细胞，3D球体，伤口愈合，血管生成。