Inhba基因敲除小鼠的生成与验证
获得合子activin A缺失的胚胎模型，并验证敲除效果。
利用CRISPR/Cas9在Inhba基因编码外显子1中插入22 bp片段，造成移码突变。通过Sanger测序确认突变，并通过ELISA检测MEF培养基中activin A水平，确认敲除后蛋白显著降低。
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合子激活素A对于小鼠植入前胚胎发育以及胚胎干细胞衍生和多能性不是必需的
Zygotic activin A is dispensable for the mouse preimplantation embryo development and for the derivation and pluripotency of embryonic stem cells†
实验完整度
高包含体外胚胎培养与延时成像、谱系标记免疫染色、囊胚体外生长模型、胚胎干细胞衍生与三胚层分化验证等多个独立证据层级。
主要模型
Inhba敲除小鼠胚胎（C57BL/6/Tar x CBA/Tar混合背景及C57BL/6/Tar近交背景） 小鼠胚胎干细胞（InhbaKO/KO、InhbaKO/WT、InhbaWT/WT） 胚胎体（EBs）
重点核对
基因型：Inhba-KO等位基因（22 bp插入）通过Sanger测序和PCR+EcoRI消化确认 胚胎培养条件：M16或KSOM培养基，5%或大气氧水平，37.5°C，5% CO2 胚胎发育阶段：从合子培养至囊胚，记录时间-lapse参数（tNEBD、t2等） ES细胞衍生：在表达LIF的培养基中，在野生型或InhbaKO/KO MEF饲养层上培养 胚状体形成：悬滴法（800个ESCs/30 μl液滴，7天培养）
摘要
在这项工作中，我们旨在确定激活素A在小鼠胚胎发生关键事件中的作用，并区分合子来源的蛋白质和母体生殖道分泌的蛋白质的功能。为此，我们记录了Inhba敲除胚胎的发育进程和表型，并使用延时成像和谱系特异性标志物的检测将其与杂合子和野生型胚胎进行比较。我们发现合子激活素A的缺乏不会损害胚胎发育至囊胚阶段的进程和速率。Inhba敲除胚胎形成功能性上胚层，这通过它们产生胚胎干细胞的能力得到证明。我们的研究首次表明，胚胎来源的胚胎干细胞的衍生、培养维持和多能性是外源性和内源性激活素A非依赖性的。然而，缺乏激活素A的胚胎的植入能力可能在体外生长试验中受损。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 合子来源的激活素A对小鼠植入前胚胎发育及胚胎干细胞衍生、多能性是否必需？
- 核心机制
- 尽管激活素A在早期胚胎和胚胎干细胞中表达，但其缺失不影响植入前发育或胚胎干细胞多能性，提示该蛋白在此阶段功能冗余；然而，合子激活素A可能通过影响滋养层细胞侵袭能力参与胚胎植入。
- 主要证据
- 利用Inhba敲除小鼠，通过延时成像分析显示胚胎发育至囊胚的效率和形态动力学参数无显著差异；免疫染色显示细胞谱系标志物正常；囊胚体外生长试验显示滋养层扩散面积减小，重组激活素A可恢复；从InhbaKO/KO胚胎成功衍生多能干细胞，并分化为三胚层。
- 研究意义
- 揭示合子激活素A对早期胚胎发育和ESC多能性非必需，但可能影响植入能力，有助于理解植入失败的遗传原因和妊娠丢失。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
植入前胚胎体外培养与形态动力学分析
评估合子activin A缺乏对胚胎发育速率和形态的影响。
从合子阶段开始培养InhbaKO/KO、InhbaKO/WT和InhbaWT/WT胚胎，使用延时成像系统记录发育过程，比较各时期时间参数和发育至囊胚的效率。
囊胚细胞谱系标志物免疫染色
检测嵌合体囊胚中TE、PE和EPI细胞谱系的正确形成。
对120h和135h的囊胚进行免疫染色，检测CDX2（TE）、SOX17（PE）、Nanog（EPI）等标志物，并统计各谱系细胞比例。
低氧和优化培养基培养验证
排除培养条件对突变表型的掩盖，在更接近体内环境下验证发育。
将胚胎在5% O2、KSOM培养基改良（高糖和EAA）中培养至囊胚，并检查谱系标志物。
囊胚体外生长试验
评估activin A缺乏对滋养层功能和植入能力的影响。
将囊胚培养在明胶包被的96孔板上，于标准ESC培养基中培养96小时，测量总面积和ICM面积，并评估滋养层迁移。还用重组activin A处理进行挽救实验。
胚胎干细胞系的衍生与培养
确定内源性和外源性activin A对ESC衍生和多能性的必要性。
从InhbaKO/KO胚胎在MEF饲养层上（野生型或InhbaKO/KO MEFs）衍生ESC系，在含LIF和2i（PD0325901，CHIR99021）的培养基中维持，检测多能性标志物（SOX2、OCT4、Nanog）和分化标志物（CDX2、SOX17）。
胚胎干细胞三胚层分化
验证activin A缺失的ESC是否保持多能性并能分化为三个胚层。
通过悬滴法形成胚状体（EBs），培养7天，提取RNA进行RT-qPCR检测各胚层标志基因（Mesp2, Mixl1, Eomes, Msgn1, Nodal；Zic1, Pax1, Pax6；Foxa2），并进行免疫荧光检测蛋白表达（Brachyury、SOX17）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | CRISPR/Cas9 | -- | -- |
| ELISA检测 | 激活素A免疫测定（人/小鼠/大鼠激活素A Quantikine ELISA试剂盒） | R&D Systems | #DAC00B |
| 胚胎培养 | M16培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| EmbryoMax高级KSOM胚胎培养基 | Sigma-Aldrich | MR-101-D | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 不含L-谷氨酰胺的必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| M2培养基 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| ES细胞衍生 | KnockOut DMEM | Gibco | -- |
| 血清替代物 | Gibco | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| GlutaMax | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠白血病抑制因子 | ESGRO, Chemicon International | -- | |
| PD0325901 | Stemgent | -- | |
| CHIR99021 | Stemgent | -- | |
| FGFR抑制剂 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 抗CDX2抗体（小鼠单克隆） | BioGenex | MU392A-UC |
| 抗CDX2抗体（兔单克隆） | Cell Signaling Technology | 12306S | |
| 抗SOX2抗体（兔多克隆） | Abcam | ab97959 | |
| 抗Nanog抗体（大鼠单克隆） | ThermoFisher Scientific | 14-5761-80 | |
| 抗SOX17抗体（山羊多克隆） | R&D Systems | AF1924 | |
| 抗GATA4抗体（山羊多克隆） | R&D Systems | AF2606 | |
| 抗OCT4抗体（小鼠单克隆） | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| 抗TROMA1抗体（大鼠单克隆） | Developmental Studies Hybridoma Bank | AB_531826 | |
| 抗Brachyury抗体（山羊多克隆） | R&D Systems | AF2085 | |
| 抗整合素α2抗体（兔单克隆） | Abcam | ab181548 | |
| 二抗 | Invitrogen | -- | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 色霉素A3 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DRAQ5 | Biostatus Ltd. | -- | |
| 成像设备 | PrimoVision成像系统 | Vitrolife | -- |
| 尼康Ti2-U显微镜 | Nikon | -- | |
| 再扫描共聚焦显微镜模块RCM1 | Confocal.nl | -- | |
| ORCA-Flash4.0 LT+相机 | Hamamatsu | -- | |
| iChrome CLE 50激光引擎 | Toptica | -- | |
| 低温培养 | HypoxyLab培养箱 | Oxford Optronix | -- |
| 分子生物学 | RNAqueous-Micro试剂盒 | Ambion | -- |
| Superscript II逆转录酶 | Invitrogen | -- | |
| Taqman探针 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| TaqMan基因表达预混液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| StepOne实时PCR系统 | Life Technologies | -- | |
| Extract-N-Amp组织PCR试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 快速循环PCR试剂盒 | Qiagen | -- | |
| EcoRI限制酶 | ThermoFisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠生成 | CRISPR/Cas9靶向Inhba外显子1的插入序列（22 bp），确认移码突变，基因分型方法（PCR+EcoRI digestion） 阅读提示：Methods: Generation of Inhba-KO mouse lines; Mouse genotyping |
| 胚胎培养和图谱分析 | 培养基（M16或KSOM）、氧浓度（大气或5%）、时间-lapse记录参数（tNEBD等）、胚胎数目和重复数 阅读提示：Methods: Time-lapse imaging and morphokinetic analysis; Culture of embryos in hypoxic conditions |
| 囊胚生长试验 | 明胶涂层浓度（0.2%）、培养基成分（无LIF）、培养时间（96h）、重组激活素A浓度（500 ng/ml）、测量面积的方法 阅读提示：Methods: Blastocyst outgrowths formation and measurement of their area |
| ES细胞衍生和培养 | 饲养层类型（野生型或敲除）、培养基成分（LIF、2i等）、传代方法 阅读提示：Methods: ESC derivation and culture |
| 胚状体分化 | 悬滴法参数（细胞数、液滴体积、培养时间）、RT-qPCR引物/探针、内参（β-actin） 阅读提示：Methods: Formation of embryoid bodies; RT-qPCR from embryoid bodies |