建立近视动物模型并验证巩膜重塑
评估形觉剥夺和远视性离焦是否诱导大鼠近视及巩膜重塑。
将大鼠分为正常对照、形觉剥夺和远视性离焦三组，处理8周后测量屈光度和眼轴长度；通过H&E染色观察巩膜胶原纤维形态，免疫组化检测α-SMA表达，Western blot检测collagen Iα1、MMP2和MMP9水平。
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Mfn2通过维持巩膜成纤维细胞内质网稳态调节近视中的巩膜重塑
Mfn2 Regulates Scleral Remodeling in Myopia by Maintaining Endoplasmic Reticulum Homeostasis in Scleral Fibroblasts
实验完整度
高包含体内动物模型（形觉剥夺和远视性离焦）和体外细胞模型（缺氧诱导SFs），并进行功能验证（Mfn2过表达/敲低）和机制验证（内质网应激、线粒体损伤、凋亡通路）。
主要模型
形觉剥夺近视大鼠模型 远视性离焦近视大鼠模型 缺氧诱导的原代大鼠巩膜成纤维细胞（SFs）
重点核对
大鼠近视模型的建立：形觉剥夺（遮眼罩）或远视性离焦（-10.0 D镜片）处理8周，验证屈光度和眼轴长度变化 体外缺氧模型：SF暴露于缺氧条件（90% N2, 5% CO2, 5% O2）24小时 Mfn2表达调节：使用oe-Mfn2过表达和sh-Mfn2敲低，并验证转染效率 内质网应激和凋亡标志物：通过WB检测PERK、GRP78、CHOP、caspase-12，以及Bax/Bcl-2等
摘要
目的：内质网应激通过调节组织重塑和凋亡参与多种疾病的发生发展。本研究旨在探讨线粒体融合蛋白2（Mfn2）介导的内质网稳定性在近视巩膜重塑中的调节作用。方法：通过形觉剥夺和远视性离焦诱导大鼠近视。在体内检测巩膜重塑、内质网应激、氧化应激和Mfn2蛋白表达。通过电子显微镜评估内质网和线粒体超微结构，并评估组织凋亡。原代大鼠巩膜成纤维细胞（SFs）暴露于缺氧环境以建立体外近视模型，并通过细胞转染干扰SFs中Mfn2的表达。评估SFs转分化程度、细胞外基质重塑、内质网应激、线粒体损伤和细胞凋亡。结果：本研究发现，近视大鼠巩膜的组织重塑伴有内质网应激和氧化应激。同时，Mfn2表达水平显著降低，内质网和线粒体结构受损，并伴随组织凋亡。体外研究表明，缺氧诱导和MFN2敲低均显著增加SFs中缺氧诱导因子-1α的表达。Mfn2过表达抑制缺氧诱导的SFs向肌成纤维细胞转分化，并上调I型胶原α1的表达。此外，Mfn2过表达减轻了缺氧诱导的SFs内质网应激和线粒体损伤，并减少SFs凋亡。结论：本研究揭示了Mfn2在维持SFs内质网稳态中的关键作用，该作用在巩膜重塑过程中发挥保护效应，并为近视提供了新的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Mfn2介导的内质网稳态是否在近视巩膜重塑中发挥调节作用？
- 核心机制
- Mfn2通过维持内质网稳态，增强巩膜成纤维细胞对缺氧诱导的内质网应激的抵抗力，抑制其向肌成纤维细胞转分化和凋亡，并上调I型胶原α1表达，从而维持细胞外基质结构稳定。
- 主要证据
- 在体内近视大鼠模型中观察到Mfn2表达下降伴随内质网应激和凋亡；在体外缺氧SFs模型中，Mfn2过表达逆转了缺氧引起的转分化、胶原降解、内质网应激、线粒体损伤和凋亡。
- 研究意义
- 首次揭示Mfn2介导的内质网稳态与近视巩膜重塑的联系，为近视提供了新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测近视巩膜中的内质网应激、氧化应激和炎症反应
探究近视巩膜中是否发生内质网应激、氧化应激及炎症反应。
通过Western blot检测PERK、GRP78、CHOP、caspase-12和HIF-1α表达；通过ELISA检测ROS、MDA、SOD、TNF-α和IL-1β水平。
评估Mfn2表达及内质网-线粒体结构
检测近视巩膜中Mfn2表达变化及内质网和线粒体超微结构损伤。
通过Western blot和免疫组化检测Mfn1、Mfn2和DRP1表达；通过透射电子显微镜观察内质网和线粒体形态；通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3和pro-caspase-3。
建立体外缺氧SFs模型并调节Mfn2表达
验证缺氧是否诱导SFs转分化及细胞外基质重塑，以及Mfn2表达变化。
原代培养大鼠SFs，缺氧处理24小时；使用oe-MFN2和sh-MFN2质粒转染进行过表达和敲低；通过CCK-8检测细胞活力，ELISA检测collagen Iα1、MMP2和MMP9分泌，Western blot和免疫荧光检测α-SMA表达。
验证Mfn2对缺氧诱导SFs内质网应激的影响
探究Mfn2是否调节缺氧诱导的SFs内质网应激。
通过Western blot检测HIF-1α、PERK、GRP78、CHOP和caspase-12表达，ELISA检测TNF-α和IL-1β，共聚焦显微镜观察PERK和calnexin荧光强度，检测Mfn1、Mfn2、DRP1和p-DRP1水平。
验证Mfn2对缺氧诱导SFs线粒体损伤和凋亡的影响
探究Mfn2是否减轻缺氧诱导的SFs线粒体损伤和凋亡。
通过共聚焦显微镜观察Mfn2和calnexin定位、MitoTracker Red染色观察线粒体分布；JC-1染色检测线粒体膜电位；流式细胞术检测ROS和细胞凋亡；Western blot检测Bax、Bcl-2、caspase-3和pro-caspase-3。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Servicebio | G4610 |
| 胎牛血清 | Pricella | 164210 | |
| 青霉素-链霉素 | Servicebio | G4003 | |
| DMEM培养基 | Servicebio | G4511 | |
| 胰蛋白酶消化液 | Servicebio | G4012 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Biosharp | BS350A |
| RNA提取与qRT-PCR | TRIzol试剂 | Biosharp | BS259A |
| 逆转录试剂盒 | Cronda | KCD-M1003 | |
| Hieff qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 实时荧光定量PCR仪 (MA-6000) | Molarray Co. Ltd. | -- | |
| 蛋白质提取与Western blot | RIPA裂解液 | Biosharp | BL504A |
| 磷酸酶抑制剂 | Servicebio | G2007 | |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo | A32955 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Biosharp | BL521A |
| Western blot | 化学发光底物试剂盒 | Millipore | WBKLS0100 |
| Western blot成像 | 化学发光成像系统 (5200) | Tanon | -- |
| 透射电子显微镜 | 透射电子显微镜 (HT-7800) | Hitachi | -- |
| 组织学/免疫组化 | 光学显微镜 (IX71) | Olympus | -- |
| 免疫组化 | Triton X-100 | -- | -- |
| DAB显色液 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | Cy3标记的山羊抗兔IgG | Servicebio | GB21303 |
| DAPI | -- | -- | |
| 免疫荧光封片 | 抗荧光淬灭封片液 | Beyotime | P0126 |
| 共聚焦显微镜 | MitoTracker Red线粒体探针 | Yeasen | 40741ES50 |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1017 | |
| 激光共聚焦显微镜 (TCS-SP8) | Leica | -- | |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1检测试剂盒 | Solarbio | M8650 |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Servicebio | G1706 |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1511 |
| ELISA | 大鼠ROS、MDA和SOD ELISA试剂盒 | JILID Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 大鼠TNF-α、IL-1β、collagen Iα1、MMP2和MMP9 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| ELISA读数 | 酶标仪 (DR-3518GL) | Diatek | -- |
| 数据统计 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
| 流式数据分析 | FlowJo软件 | -- | -- |
| 图像分析 | ImageJ软件 | -- | -- |
| 动物造模 | 半透明乳胶遮眼罩 | -- | -- |
| 镜片 (-10.0 D) | -- | -- | |
| 验光 | 带状光检影镜 (YZ24B) | 66 Vision Technologies Co., Ltd. | -- |
| 眼轴测量 | A超 (SW-2100) | Suoer | -- |
| 麻醉 | 盐酸布比卡因 | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 模型类型（形觉剥夺/远视性离焦）、处理时间（8周）、动物性别、周龄、品系、每组样本量（5只） 阅读提示：Methods中的Animals及Establishment of the Myopia Models and Ocular Measurements |
| 原代SFs培养与处理 | scleral tissue来源、培养基成分、缺氧条件（90% N2, 5% CO2, 5% O2）、缺氧时间（24小时）、转染试剂和质粒浓度 阅读提示：Methods中的Cultivation and Treatments of SFs |
| 内质网应激和凋亡检测 | 检测指标（PERK、GRP78、CHOP、caspase-12、Bax、Bcl-2等）、抗体稀释比、蛋白上样量 阅读提示：Methods中的Western Blotting及补充表S2 |
| 线粒体功能检测 | JC-1染色时间、MitoTracker Red孵育时间、流式检测ROS和凋亡的孵育条件 阅读提示：Methods中的Mitochondrial Membrane Potential Detection、Flow Cytometry Analysis of Reactive Oxygen Species和Flow Cytometry Analysis of Apoptosis |
| 统计方法 | 统计检验选择（1-way ANOVA、two-way ANOVA、独立样本t检验、配对t检验）、事后校正方法（Bonferroni、Dunn）、显著性水平（P<0.05） 阅读提示：Methods中的Statistical Analyses |