获取人类角膜缘组织样本
获得用于空间转录组和免疫荧光等实验的健康人类角膜缘组织。
收集两个供体角膜缘环（51岁和61岁），在显微镜下去除角膜缘边缘的结膜和外层巩膜。
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人类角膜缘的空间转录组图谱及调控角膜缘上皮干细胞命运的生态位微环境
The Spatial Transcriptomic Atlas of Human Limbus and Vital Niche Microenvironment Regulating the Fate of Limbal Epithelial Stem Cells
实验完整度
中包含空间转录组、单细胞数据整合、免疫荧光、siRNA敲低等实验，有功能验证与机制分析，但主要依赖生信分析，体内及临床验证有限。
主要模型
人类角膜缘组织（供体角膜缘环） 原代角膜缘上皮干细胞（LESCs） 角膜上皮细胞
重点核对
空间转录组数据为每样本444-554个点，平均基因数5057-2773。 GPHB5敲低实验：使用50 nM siRNA靶向GPHB5，转染72小时后检测CK14和CK15表达。 RCTD分析参数：每个细胞类型至少一个细胞，每个点至少一个唯一分子标识符，doublet mode设为FALSE。 差异表达基因筛选阈值：调整后P值<0.05，|log2foldchange|>0.58。 组织样本：2例（51岁，猝死，24小时内；61岁，车祸，24小时内）。
摘要
目的：本研究旨在利用空间转录组技术生成人类角膜缘的空间图谱，并揭示生态位微环境之间的深层相互作用。方法：使用10× Genomics Space Ranger软件平台对人类角膜缘进行空间转录组图谱分析。下载人类角膜缘上皮干细胞（LESCs）的单细胞RNA测序数据进行整合分析。结果：我们在每个样本中绘制了超过400个点，并在角膜缘区域内空间定位了主要细胞类型。LESCs主要定位于基底膜，而角膜缘生态位细胞主要位于基质区域。接下来，根据组织学结构将角膜缘分为四个区域，并分析了四个区域间的差异表达基因。值得注意的是，GPHB5在中间区域的上皮中高表达，并与ΔNp63共染色，提示其可能是一种新的LESCs潜在生物标志物。随后，发现角膜缘间充质干细胞表现出与LESCs相关的最大配体数量。COL6A2/CD44信号在角膜缘间充质干细胞、黑色素细胞、免疫细胞和LESCs中的广泛活性表明其在通过胶原途径介导双向通讯中的重要作用。结论：本研究绘制了角膜缘生态位内关键细胞的空间定位，并详细描述了主要细胞类型之间的相互作用。这些发现为后续LESCs研究提供了基础，并增进了我们对角膜生物学的理解。关键词：角膜缘上皮干细胞，生态位微环境，空间转录组，GPHB5，细胞间通讯。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 角膜缘生态位微环境如何调控角膜缘上皮干细胞（LESCs）的命运？
- 核心机制
- LMSCs通过分泌大量配体与LESCs相互作用，其中COL6A2/CD44信号在多种细胞类型间广泛活跃，通过ECM-受体相互作用介导双向通讯。
- 主要证据
- 空间转录组和单细胞RNA测序数据整合显示LMSCs具有最多与LESCs相关的配体；COL6A2/CD44的激活通过多种细胞对共定位和免疫荧光验证。
- 研究意义
- 为理解LESCs的生态位微环境提供空间层面的基础，为角膜缘干细胞缺乏症的治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间转录组文库制备与测序
生成人类角膜缘的空间转录组图谱，以定位细胞类型和基因表达。
将新鲜角膜缘组织包埋于OCT，冷冻切片，进行甲醇固定、HE染色、成像、脱色，然后进行探针杂交、释放并转移至Visium CytAssist玻片，使用Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE试剂盒构建文库，用PE-150模式测序。
空间转录组数据处理与细胞类型鉴定
处理空间转录组数据并识别主要细胞类型及其空间分布。
使用Space Ranger（版本2.0.1）处理FASTQ文件，比对到GRCh38参考基因组，定量UMI。然后使用Seurat（版本4.1.0）进行归一化、PCA、聚类和UMAP可视化。使用RCTD（版本1.1.0）推断每个点的细胞类型组成。
角膜缘区域划分及差异表达基因分析
基于组织学结构划分角膜缘为四个区域，并分析区域间差异表达基因和生物学通路。
根据HE染色结果，将角膜缘划分为内区、中区上皮层、中区基质层和外区。使用FindMarkers函数筛选差异表达基因（阈值：调整P值<0.05，|log2FC|>0.58），并进行GO和KEGG富集分析。
免疫荧光验证关键基因表达和定位
验证GPHB5、PERP等关键基因在角膜缘组织中的表达和细胞定位。
对角膜缘组织切片进行免疫荧光染色，使用针对ALCAM、PERP、GPHB5、ΔNp63、CK14、CK3、CK12、MELANA和TYRP1的抗体，以及DAPI核染色，荧光显微镜拍照。
GPHB5功能验证（siRNA敲低）
验证GPHB5对LESCs干性维持的影响。
使用Lipofectamine 3000将靶向GPHB5的siRNA（50 nM）转染LESCs，转染后72小时收集细胞，检测CK14和CK15的基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
空间转录组数据分析
差异表达与通路富集分析
转录因子调控网络分析
细胞周期分析
细胞通讯分析
免疫荧光验证
基因敲低验证
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织包埋与切片 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| 空间转录组学 | 10x Visium CytAssist FFPE空间基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| 数据预处理 | Space Ranger软件（版本2.0.1） | 10x Genomics | -- |
| 免疫荧光染色 | ALCAM抗体 | Proteintech | 21972-1-AP |
| PERP抗体 | Signalway Antibody | 49745 | |
| GPHB5抗体 | Signalway Antibody | 48970 | |
| ΔNp63抗体 | Cell Signaling Technology | 67825 | |
| CK14抗体 | Abcam | ab119695 | |
| CK3抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80000 | |
| CK12抗体 | Proteintech | 24789-1-AP | |
| MELANA抗体 | Proteintech | 60348-1-Ig | |
| TYRP1抗体 | HUABIO | ET7106-66 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 靶向GPHB5的siRNA | Helix Biotech, Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织样本 | 供体年龄（51岁和61岁）、死亡原因、离体时间（均在24小时内）、样本处理方式 阅读提示：Materials and Methods: Tissue Preparation |
| 空间转录组实验 | OCT包埋、冷冻切片、甲醇固定、HE染色、探针杂交、CytAssist转移、文库构建试剂盒（Visium CytAssist Spatial Gene Expression for FFPE kit）、测序模式PE-150 阅读提示：Materials and Methods: 10× Visium Spatial RNA-seq Data Preprocessing |
| 空间转录组数据分析 | Space Ranger版本2.0.1、参考基因组GRCh38、Seurat版本4.1.0、Sctransform归一化、FindClusters聚类、RCTD参数（每个细胞类型至少一个细胞，每个点至少一个UMI，doublet模式=FALSE） 阅读提示：Materials and Methods: 10× Visium Spatial RNA-seq Data Preprocessing; Robust Cell Type Decomposition (RCTD) Analysis |
| 差异表达分析 | FindMarkers函数（test.use=presto）、调整后P值<0.05、|log2FC|>0.58、R版本4.0.3 阅读提示：Materials and Methods: Differentially Expressed Genes |
| 免疫荧光染色 | 抗体列表（ALCAM, PERP, GPHB5, ΔNp63, CK14, CK3, CK12, MELANA, TYRP1）及品牌/货号、一抗孵育4°C过夜、二抗37°C 1小时、DAPI染色20分钟 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence Staining |
| GPHB5敲低实验 | LESCs接种密度（转染时约50%）、siRNA浓度（50 nM）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、转染时间（72小时）、检测基因（CK14, CK15） 阅读提示：Materials and Methods: Transfection |