样本收集与病理诊断
收集颅咽管瘤样本并确认亚型诊断。
收集2012-2022年间24个FFPE肿瘤样本，经神经病理学家根据HE染色和IHC（β-catenin或BRAF p.V600E）确诊。一个ACP样本因钙化排除。
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利用全转录组和空间转录组方法对颅咽管瘤进行全面的分子特征分析
Comprehensive molecular characterization of craniopharyngiomas using whole transcriptome and spatial transcriptomics approaches
实验完整度
中研究包含24例肿瘤样本的转录组测序、差异表达分析、Sanger验证及空间转录组分析，但缺乏功能实验和动物模型，验证层级有限。
主要模型
成釉细胞型颅咽管瘤（ACP）肿瘤样本 乳头状颅咽管瘤（PCP）肿瘤样本 健康垂体组织（GTEx）
重点核对
样本类型：FFPE肿瘤样本，ACP 13例，PCP 4例 突变检测：转录组测序的CTAT流程，部分用靶向DNA测序和Sanger验证 差异表达分析：DESeq2，比较ACP、PCP和健康垂体（GTEx） 空间转录组：Xenium，3个样本（2 ACP，1 PCP），377基因panel DNA污染：6个ACP样本因DNA污染排除在DGE分析外
摘要
颅咽管瘤（CPs）是罕见的良性脑肿瘤，被归类为WHO I级，有两种亚型：成釉细胞型颅咽管瘤（ACP）和乳头状颅咽管瘤（PCP）。ACP由CTNNB1基因外显子3的体细胞突变引起，激活Wnt信号通路。PCP与激活MAPK信号通路的体细胞BRAF p.V600E突变相关。了解它们的分子差异对于诊断和治疗至关重要。本研究旨在利用批量转录组测序和原位空间转录组学分析ACP和PCP中常见的体细胞改变。使用RNA测序和高分辨率空间分析来检测突变并检查ACP、PCP和健康垂体组织之间的基因表达差异。对24个肿瘤样本进行了全转录组测序，健康垂体数据来自GTEx门户。生物信息学分析利用CTAT突变流程，并使用Sanger测序进行验证。结果证实所有PCP样本均存在BRAF p.V600E突变，所有ACP样本均存在CTNNB1突变。差异基因表达分析突出了不同的分子谱，并加强了Wnt和MAPK信号的参与。空间分析确定了ACP和PCP之间的41个差异表达基因。这项研究为CP生物学提供了重要的见解，支持改进诊断和潜在的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 颅咽管瘤两种亚型在转录组水平和空间分布上的分子特征差异，以及转录组学方法在诊断和潜在治疗中的价值。
- 核心机制
- ACP由CTNNB1外显子3突变激活Wnt信号通路，PCP由BRAF p.V600E突变激活MAPK信号通路；空间转录组揭示ACP中Wnt负调控因子APCDD1上调等差异表达基因涉及的生物学过程。
- 主要证据
- 全转录组测序检测到所有ACP样本CTNNB1外显子3突变和所有PCP样本BRAF p.V600E突变；Sanger测序验证部分CTNNB1突变；差异表达分析显示ACP中Wnt靶基因和角蛋白基因上调，垂体激素基因下调；Xenium空间转录组鉴定出41个差异表达基因，并发现13个细胞簇。
- 研究意义
- 该研究提供了颅咽管瘤分子特征的见解，支持改进诊断和潜在的治疗策略，并强调了空间转录组学在罕见肿瘤研究中的价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RNA提取与转录组测序
获取全转录组表达数据，用于突变检测和差异表达分析。
使用Promega Maxwell RSC RNA FFPE Kit提取RNA，QIAseq Stranded RNA Library Kit构建文库，NovaSeq平台测序，平均50M reads。数据经fastp预处理，STAR比对。
体细胞突变检测与验证
检测ACP和PCP中的驱动突变，并验证转录组检测结果的准确性。
使用CTAT突变流程从RNA测序数据中检测突变；对3个低频率CTNNB1突变样本进行Sanger测序验证；部分样本使用AmpliSeq靶向DNA测序。
差异基因表达分析
比较ACP、PCP和健康垂体之间的基因表达差异，揭示分子特征。
使用RNASeqChef标准DESeq2流程进行DGE分析，排除6个DNA污染的ACP样本后，分析13个ACP、4个PCP和49个健康垂体样本；关注Wnt/MAPK通路、角蛋白、垂体激素等基因。
空间转录组分析
在空间水平上分析基因表达，揭示肿瘤微环境中的细胞异质性和差异表达基因。
对三个FFPE切片（2 ACP, 1 PCP）使用Xenium平台，采用人类多组织和癌症panel（377个基因），进行探针杂交、连接、扩增和测序；使用Xenium Explorer和Seurat进行聚类和注释，DESeq2分析差异表达基因。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | Benchmark XT | Ventana Medical Systems Inc. | -- |
| 抗BRAF (VE1)抗体 | Abcam plc | ab228461 | |
| β-连环蛋白（14）抗体 | Cell Marque | 224M-15 | |
| iVIEW DAB检测试剂盒 | Ventana Medical Systems Inc. | -- | |
| RNA提取 | Promega Maxwell RSC RNA FFPE试剂盒 | Promega Corporation | -- |
| 文库构建 | QIAseq链特异性RNA文库试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 测序平台 | NovaSeq平台 | Illumina | -- |
| 逆转录 | IonTorrent NGS逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PCR扩增 | FastGene Optima热启动预混液 | Nippon Genetics Europe | -- |
| PCR产物纯化 | ExoSAP-IT | Applied Biosystems | -- |
| Sanger测序 | BigDye Terminator循环测序试剂盒3.1 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| BigDye XTerminator纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SeqStudio | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 靶向DNA测序 | Promega Maxwell RSC DNA FFPE试剂盒 | Promega Corporation | -- |
| AmpliSeq文库试剂盒Plus | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 空间转录组学 | 人类多组织和癌症基因面板 | 10x Genomics | PN-1000626 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与诊断 | 样本类型为FFPE，ACP和PCP样本数量，诊断基于HE和IHC；需核对样本存储条件和排除标准（如ACP_12因钙化排除）。 阅读提示：Materials and methods: Tumor samples |
| RNA提取与测序 | RNA提取试剂盒（Promega Maxwell RSC RNA FFPE Kit），文库构建试剂盒（QIAseq Stranded RNA Library Kit），测序平台（NovaSeq），平均测序深度（50M reads）；需核对FFPE RNA提取的具体步骤和DNase处理。 阅读提示：Materials and methods: RNA extraction, library preparation and sequencing |
| 突变检测 | CTAT突变流程参数，Sanger验证的样本和条件，靶向DNA测序的基因panel（OCCRA）和扩增循环数；需核对低频率突变的阈值和处理。 阅读提示：Materials and methods: Mutation detection and differential expression analysis; Targeted DNA sequencing library preparation |
| 差异表达分析 | 样本分组（13 ACP, 4 PCP, 49 healthy），排除标准（DNA污染），归一化方法（DESeq2，rlog），统计检验（Mann-Whitney U test）；需核对GTEx数据版本和选择标准。 阅读提示：Materials and methods: Mutation detection and differential expression analysis; Expression analysis in Results |
| 空间转录组学 | Xenium平台，基因panel（Human Multi-tissue and Cancer, 377基因），组织处理协议（参考CG000578, CG000580, CG000549, CG000613），细胞聚类方法（Seurat），差异表达阈值（padj<0.01）；需核对样本数量（2 ACP, 1 PCP）和参考数据集。 阅读提示：Materials and methods: Spatial transcriptomic analysis of PCP and two ACP samples; Spatial transcriptomic (Xenium) in Results |