Comparative analyses of immune cells and alpha-smooth muscle actin-positive cells under the immunological microenvironment between with and without dense fibrosis in primary central nervous system lymphoma
该研究为回顾性临床病理分析，包括组织染色（银染、Masson染色）和免疫组化，对比了纤维化组和对照组中αSMA、GFAP、CD3、CD4、CD8、PD-1、Foxp3、CD68、CD163的表达，并进行了相关性分析和生存分析。
PCNSL肿瘤组织标本（福尔马林固定石蜡包埋切片）
肿瘤质地的判定基于手术记录，未进行客观测量 纤维化组定义：银染网状纤维评分为+3（致密网状纤维聚集伴胶原沉积） αSMA阳性细胞评估：仅计数梭形细胞，分为0-3+等级 免疫细胞计数：在肿瘤中心和边缘各选取3个热点，在高倍镜（×400）下计数 对照组的选取：从非纤维化肿瘤中按GCB和非GCB亚型比例匹配随机选择
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
根据手术记录中的肿瘤质硬描述和病理纤维化程度，将PCNSL样本分为纤维化组和对照组。
回顾性筛选2015年1月至2023年6月期间手术的PCNSL病例，排除继发CNS淋巴瘤、非DLBCL组织学、HIV相关淋巴瘤、术前使用类固醇及样本不足者。将手术记录明确提及质硬的10例肿瘤中排除1例后，对9例质硬肿瘤和26例非质硬肿瘤进行银染评估，以银染网状纤维评分为+3定义为纤维化组（共6例），并从非质硬肿瘤中随机匹配GCB/非GCB亚型选择7例作为对照组。
观察PCNSL中致密纤维化的形态学特征，包括网状纤维和胶原沉积。
对4μm厚的FFPE切片进行HE和Masson三色染色，对7.5μm厚切片进行银浸染（Watanabe法）以显示网状纤维（黑色）和胶原（红色），并由两名病理学家对网状纤维进行0-+3评分。
评估纤维化组和对照组中αSMA、GFAP及免疫细胞标志物的表达差异。
使用自动化免疫组化染色仪（BenchMark-ULTRA或Discovery-ultra）对4μm FFPE切片进行CD20、CD3、CD4、CD8、PD-1、CD68、CD163、αSMA和GFAP的免疫组化染色；Foxp3采用手动染色，使用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）高压抗原修复，4°C孵育过夜。评估时，CD3、CD4、CD8、Foxp3、PD-1、CD68、CD163在低倍镜（×40）下选择肿瘤中心和边缘各3个热点，在高倍镜（×400）下计数阳性细胞；αSMA和GFAP在低倍镜和中倍镜（×200）下选择密度最高区域，按0-3+等级分类。
探讨纤维化程度、αSMA表达与免疫细胞浸润之间的关联。
使用配对t检验比较肿瘤中心与边缘的免疫细胞数量；使用Mann-Whitney U检验比较纤维化组与对照组的细胞数量；使用Spearman相关分析评估αSMA和GFAP表达与免疫细胞数量的相关性。根据αSMA评分（0为阴性，≥1为阳性）分组，比较免疫细胞数量的差异。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织固定 | 10%福尔马林 | Mitsubishi Gas Chemical | -- |
| 免疫组化 | BenchMark-ULTRA自动染色仪 | Ventana Medical Systems | -- |
| Discovery-ultra自动染色仪 | Ventana Medical Systems | -- | |
| EZ prep | Roche | 950-102 | |
| 细胞调理液（CC1） | Roche | 951-124 | |
| Ultra-View DAB通用试剂盒 | Roche | 760-500 | |
| 蓝化剂 | Roche | 760-2037 | |
| 抗Foxp3抗体 | -- | -- | |
| 图像分析 | Fiji软件 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病例筛选与分组 | 手术记录中是否明确描述肿瘤质硬；纤维化组的定义需通过银染网状纤维评分（+3）确认；对照组的匹配标准 阅读提示：参阅Methods中Patients部分及Fig. 2流程图 |
| 组织病理学染色 | 银染方法（Watanabe法）；切片厚度；网状纤维评分标准 阅读提示：参阅Methods中Histopathology and evaluation of fibrous status部分及Fig. 1a |
| 免疫组化检测 | 抗体克隆号和稀释比例；抗原修复条件；染色平台；免疫细胞计数方法（热点数、视野大小） 阅读提示：参阅Methods中Immunohistochemistry and evaluation部分及Supplemental Table 1 |
| 统计分析 | 使用的统计方法（MWU、配对t检验、相关分析、log-rank）；显著性阈值（p<0.05）；软件版本 阅读提示：参阅Methods中Statistics部分 |
