制备单细胞悬液
从小鼠视网膜和脉络膜中获得可用于流式分选的单细胞悬液。
通过三步酶消化(dispase、胶原酶、II型胶原酶)和过滤、红细胞裂解等步骤,制备单细胞悬液。
Identification of CD157-Positive Vascular Endothelial Stem Cells in Mouse Retinal and Choroidal Vessels: Fluorescence-Activated Cell Sorting Analysis
包含体外培养和免疫组化验证,但缺少体内功能验证;通过FACS分析比例、体外网络形成和KO对照确认特异性。
小鼠视网膜组织 小鼠脉络膜组织 原代CD157阳性血管内皮干细胞 OP9基质细胞共培养体系
使用C57BL/6J雌性小鼠(8-12周龄) 酶消化方案(dispase 1.2 U/mL,胶原酶1 mg/mL,II型胶原酶1 mg/mL,各步孵育时间5-7分钟) FACS分选门控策略(排除碎片、死细胞、双联体) 体外培养条件(OP9饲养层,VEGF 10 ng/mL,培养10天) CD157-KO小鼠作为抗体特异性对照
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从小鼠视网膜和脉络膜中获得可用于流式分选的单细胞悬液。
通过三步酶消化(dispase、胶原酶、II型胶原酶)和过滤、红细胞裂解等步骤,制备单细胞悬液。
鉴定并分选视网膜和脉络膜中的CD157阳性血管内皮干细胞。
对单细胞悬液进行免疫染色(CD31-BV421、CD45-FITC、CD157-APC),使用FACS分选VESCs(CD31+CD45−CD157+)。
评估CD157阳性VESCs的增殖能力。
将分选的VESCs和non-VESCs培养在OP9饲养层上,10天后进行CD31免疫染色,量化EC网络面积。
确定CD157阳性VESCs在视网膜和脉络膜血管中的位置。
对野生型小鼠视网膜和脉络膜进行全组织铺片免疫染色,检测CD31和CD157表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 制备单细胞悬液 | 分散酶 | Gibco | 17105-041 |
| 胶原酶 | Wako | 034-22363 | |
| II型胶原酶 | Worthington | LS004176 | |
| 氯化钙 | Honeywell Fluka | 21114-1L | |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| ACK裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | |
| 免疫染色 | CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | 553142 |
| CD31-BV421抗体 | BioLegend | 102423 | |
| CD45-FITC抗体 | Thermo Fisher Scientific | 11-0451-85 | |
| CD157-APC抗体 | BioLegend | 140208 | |
| 流式分选 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4170-10MG |
| FACS Aria II SORP分选仪 | BD | -- | |
| 体外培养 | OP9基质细胞 | RIKEN cell bank | RCB1124 |
| RPMI培养基 | Sigma-Aldrich | R8758-500ML | |
| 血管内皮生长因子165 | PeproTech | 100-20 | |
| 免疫染色(体外) | 抗CD31单克隆抗体 | BD Biosciences | 553370 |
| 免疫染色(组织) | CD157-PE抗体 | BioLegend | 140204 |
| 图像分析 | ImageJ软件 | National Institutes of Health | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 制备单细胞悬液 | 酶种类、浓度、孵育时间、温度 阅读提示:Methods: Preparation of Enzymes for Single-Cell Suspension and Creating a Single-Cell Suspension |
| FACS分选 | 抗体克隆、用量、门控策略、分选纯度 阅读提示:Methods: Immunostaining of Single-Cell Suspension and Isolation of CD157-Positive VESCs by FACS |
| 体外培养 | OP9细胞密度、VESC接种密度、培养基成分、VEGF浓度、培养时间 阅读提示:Methods: In Vitro Culture of CD157-Positive VESCs |
| 免疫组化 | 抗体稀释比、固定时间、组织处理步骤 阅读提示:Methods: Immunostaining the Whole-Mount Retina and Choroid |