小鼠视网膜和脉络膜血管中CD157阳性血管内皮干细胞的鉴定:荧光激活细胞分选分析

Identification of CD157-Positive Vascular Endothelial Stem Cells in Mouse Retinal and Choroidal Vessels: Fluorescence-Activated Cell Sorting Analysis

作者信息Taku Wakabayashi, Hisamichi Naito, Tomohiro Iba, Kohji Nishida, Nobuyuki Takakura
PMID35394492
发布时间2022-04-01
DOI10.1167/iovs.63.4.5

实验完整度

包含体外培养和免疫组化验证,但缺少体内功能验证;通过FACS分析比例、体外网络形成和KO对照确认特异性。

主要模型

小鼠视网膜组织 小鼠脉络膜组织 原代CD157阳性血管内皮干细胞 OP9基质细胞共培养体系

重点核对

使用C57BL/6J雌性小鼠(8-12周龄) 酶消化方案(dispase 1.2 U/mL,胶原酶1 mg/mL,II型胶原酶1 mg/mL,各步孵育时间5-7分钟) FACS分选门控策略(排除碎片、死细胞、双联体) 体外培养条件(OP9饲养层,VEGF 10 ng/mL,培养10天) CD157-KO小鼠作为抗体特异性对照

摘要

目的 CD157(也称为Bst1)阳性的血管内皮干细胞(VESCs)最近在小鼠器官中被发现,包括视网膜、脑、肝、肺、心和皮肤,它们有助于血管再生。然而,在脉络膜中尚未鉴定出VESCs。本研究旨在鉴定脉络膜血管中的VESCs,并建立分离视网膜和脉络膜VESCs的方案。 方法 我们建立了一种高效方案,通过使用分散酶、胶原酶和II型胶原酶的酶消化,从新鲜分离的小鼠视网膜和脉络膜中制备单细胞悬液。使用荧光激活细胞分选(FACS)分选CD157阳性VESCs(定义为CD31+CD45−CD157+细胞)。 结果 在小鼠视网膜中,根据FACS分析,在CD31+CD45−内皮细胞(ECs)中,1.6 ± 0.2%为CD157阳性VESCs。在小鼠脉络膜中,在CD31+CD45−ECs中,4.5 ± 0.4%为VESCs。在血管内皮生长因子(VEGF)体外培养条件下,CD157阳性VESCs形成的EC网络数量高于CD157阴性非VESCs。EC网络面积(定义为每个视野中CD31阳性面积与总面积的比值)分别为4.21 ± 0.39%(视网膜VESCs)和0.27 ± 0.12%(视网膜非VESCs)(P < 0.01)。EC网络面积分别为8.59 ± 0.78%(脉络膜VESCs)和0.14 ± 0.04%(脉络膜非VESCs)(P < 0.01)。VESCs位于大血管中,而不在毛细血管中。 结论 我们确认了小鼠视网膜和脉络膜中不同的CD157阳性VESCs群体。VESCs位于大血管中,并具有增殖潜力。目前的结果可能为眼部血管疾病的研究和治疗开辟新途径。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
本研究旨在确定脉络膜血管中是否存在CD157阳性血管内皮干细胞,并建立从小鼠视网膜和脉络膜中分离VESCs的详细方案。
核心机制
CD157阳性VESCs位于大血管(静脉和毛细血管后微静脉)中,具有高增殖潜力,可能参与血管生成;但具体分子机制未阐明。
主要证据
通过FACS分析显示视网膜和脉络膜EC中CD157阳性VESCs的比例分别为1.6%和4.5%;体外培养证实VESCs形成的EC网络面积显著高于非VESCs;免疫组化显示CD157阳性细胞位于大血管而非毛细血管。
研究意义
该结果可能为眼部血管疾病的研究和治疗开辟新途径,并可能为血管再生治疗(如缺血性视网膜疾病)和抗血管生成治疗提供基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

制备单细胞悬液

从小鼠视网膜和脉络膜中获得可用于流式分选的单细胞悬液。

通过三步酶消化(dispase、胶原酶、II型胶原酶)和过滤、红细胞裂解等步骤,制备单细胞悬液。

2

流式分选CD157阳性VESCs

鉴定并分选视网膜和脉络膜中的CD157阳性血管内皮干细胞。

对单细胞悬液进行免疫染色(CD31-BV421、CD45-FITC、CD157-APC),使用FACS分选VESCs(CD31+CD45−CD157+)。

3

体外培养VESCs并评估内皮网络形成

评估CD157阳性VESCs的增殖能力。

将分选的VESCs和non-VESCs培养在OP9饲养层上,10天后进行CD31免疫染色,量化EC网络面积。

4

免疫染色定位VESCs

确定CD157阳性VESCs在视网膜和脉络膜血管中的位置。

对野生型小鼠视网膜和脉络膜进行全组织铺片免疫染色,检测CD31和CD157表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
分散酶Gibco17105-041
胶原酶Wako034-22363
II型胶原酶WorthingtonLS004176
氯化钙Honeywell Fluka21114-1L
氯化镁Sigma-AldrichM1028-100ML
ACK裂解缓冲液Lonza10-548E
CD16/CD32抗体BD Biosciences553142
CD31-BV421抗体BioLegend102423
CD45-FITC抗体Thermo Fisher Scientific11-0451-85
CD157-APC抗体BioLegend140208
碘化丙啶Sigma-AldrichP4170-10MG
FACS Aria II SORP分选仪BD--
OP9基质细胞RIKEN cell bankRCB1124
RPMI培养基Sigma-AldrichR8758-500ML
血管内皮生长因子165PeproTech100-20
抗CD31单克隆抗体BD Biosciences553370
CD157-PE抗体BioLegend140204
ImageJ软件National Institutes of Health--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
制备单细胞悬液
酶种类、浓度、孵育时间、温度
阅读提示:Methods: Preparation of Enzymes for Single-Cell Suspension and Creating a Single-Cell Suspension
FACS分选
抗体克隆、用量、门控策略、分选纯度
阅读提示:Methods: Immunostaining of Single-Cell Suspension and Isolation of CD157-Positive VESCs by FACS
体外培养
OP9细胞密度、VESC接种密度、培养基成分、VEGF浓度、培养时间
阅读提示:Methods: In Vitro Culture of CD157-Positive VESCs
免疫组化
抗体稀释比、固定时间、组织处理步骤
阅读提示:Methods: Immunostaining the Whole-Mount Retina and Choroid