缺氧条件下HCVECs产生和释放CSF1
验证缺氧是否影响脉络膜血管内皮细胞CSF1的表达和分泌。
将HCVECs分为常氧组和缺氧组，分别用qRT-PCR检测CSF1 mRNA水平，Western blot检测CSF1蛋白水平，ELISA检测培养上清中CSF1浓度。
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CSF1/CSF1R介导的脉络膜血管内皮细胞与巨噬细胞之间的串扰促进脉络膜新生血管形成
CSF1/CSF1R-mediated Crosstalk Between Choroidal Vascular Endothelial Cells and Macrophages Promotes Choroidal Neovascularization
实验完整度
高包含细胞实验（原代细胞共培养、抑制剂干预）、动物模型（激光诱导CNV）、临床样本（nAMD患者房水），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
人脉络膜血管内皮细胞（HCVECs） 人外周血单核细胞来源的巨噬细胞 小鼠激光诱导CNV模型（C57BL/6J小鼠） nAMD患者房水样本
重点核对
HCVECs缺氧条件：1% O2，94% N2，5% CO2 巨噬细胞处理：CSF1重组蛋白（216-MC）、CSF1R抑制剂PLX3397（10 µM，24小时）、CSF1中和抗体（MAB216，0.2 µg/mL，24小时）、PI3K/AKT抑制剂LY294002（10 µM，24小时）、FOXO1抑制剂AS1842856（0.1 µM，24小时） 共培养系统：HCVECs与巨噬细胞在缺氧或常氧条件下共培养 动物模型：C57BL/6J小鼠，激光诱导CNV，激光参数：波长532 nm，光斑直径200 µm，持续时间20 ms，功率120 mW，每眼4个光斑 体内给药：CSF1中和抗体或PLX3397在CNV诱导后第1天注射，组别包括CNV 7天+PBS、CSF1中和抗体、PLX3397、conbercept（1 µL，10 mg/mL，玻璃体腔注射）
摘要
目的：本研究探讨了CSF1/CSF1R轴在脉络膜新生血管（CNV）形成过程中脉络膜血管内皮细胞（CVECs）与巨噬细胞之间的串扰中的作用。方法：采用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western blot和ELISA检测人脉络膜血管内皮细胞（HCVECs）在缺氧条件下CSF1的产生和释放。Western blot检测缺氧条件下HCVECs释放的CSF1通过结合CSF1R激活人巨噬细胞中的PI3K/AKT/FOXO1轴。Transwell迁移实验、qRT-PCR和Western blot检测HCVECs释放的CSF1通过CSF1R/PI3K/AKT/FOXO1通路对巨噬细胞迁移和M2极化的影响。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入实验、Transwell迁移和管形成实验检测CSF1/CSF1R对HCVECs行为的影响。眼底荧光素血管造影（FFA）、吲哚菁绿血管造影（ICGA）和免疫荧光检测CSF1/CSF1R阻断对小鼠激光诱导CNV的影响。彩色眼底照相、ICGA和FFA检测新生血管性AMD（nAMD）患者的CNV病变。ELISA检测年龄相关性白内障和nAMD患者房水中CSF1和CSF1R的水平。结果：缺氧条件下HCVECs释放的CSF1通过结合CSF1R激活人巨噬细胞中的PI3K/AKT/FOXO1轴，通过上调CSF1R/PI3K/AKT/FOXO1通路促进巨噬细胞迁移和M2极化。人巨噬细胞在缺氧条件下以CSF1/CSF1R依赖性方式促进HCVECs的增殖、迁移和管形成。CSF1/CSF1R阻断改善了小鼠激光诱导CNV的形成。nAMD患者房水中CSF1和CSF1R升高。结论：我们的结果证实了CSF1/CSF1R在促进CNV形成中的关键作用，并为nAMD的治疗提供了潜在的分子靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CSF1/CSF1R轴在脉络膜血管内皮细胞与巨噬细胞之间的串扰中是否促进脉络膜新生血管的形成？
- 核心机制
- 缺氧条件下，脉络膜血管内皮细胞释放CSF1，CSF1与巨噬细胞表面的CSF1R结合，激活PI3K/AKT/FOXO1通路，促进巨噬细胞迁移和M2极化；M2型巨噬细胞以CSF1/CSF1R依赖性方式促进内皮细胞增殖、迁移和管形成，进而促进CNV形成。
- 主要证据
- 体外实验显示缺氧条件下HCVECs分泌CSF1，激活巨噬细胞CSF1R/PI3K/AKT/FOXO1通路，促进迁移和M2极化；巨噬细胞促进HCVECs增殖、迁移和管形成；体内实验显示CSF1/CSF1R阻断减轻小鼠激光诱导CNV的渗漏和面积；临床样本显示nAMD患者房水中CSF1和CSF1R水平升高。
- 研究意义
- 研究证实了CSF1/CSF1R轴在CNV形成中的关键作用，为nAMD的治疗提供了潜在的分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CSF1激活巨噬细胞PI3K/AKT/FOXO1通路
探讨HCVECs释放的CSF1是否通过CSF1R激活巨噬细胞中的PI3K/AKT/FOXO1通路。
将人巨噬细胞分为不同处理组，包括CSF1重组蛋白、CSF1R抑制剂、共培养等，Western blot检测相关蛋白磷酸化水平。
验证CSF1对巨噬细胞迁移和M2极化的影响
确定CSF1是否通过CSF1R/PI3K/AKT/FOXO1通路促进巨噬细胞迁移和M2极化。
采用Transwell迁移实验检测巨噬细胞迁移，qRT-PCR和Western blot检测M1标志物iNOS和M2标志物Arg1的表达。
验证巨噬细胞对HCVECs功能的影响
探讨M2型巨噬细胞是否以CSF1/CSF1R依赖性方式促进HCVECs的增殖、迁移和管形成。
将HCVECs与巨噬细胞共培养，分别用EdU实验、Transwell迁移实验和管形成实验检测HCVECs的增殖、迁移和管形成能力。
体内验证CSF1/CSF1R阻断对CNV的影响
评估CSF1/CSF1R阻断对小鼠激光诱导CNV的抑制作用。
建立小鼠激光诱导CNV模型，在第1天给予CSF1中和抗体或PLX3397，第7天处死小鼠，通过Western blot检测相关蛋白，ELISA检测VEGF，FFA和ICGA评估渗漏和面积，choroidal flat mounts评估体积。
临床样本验证
评估nAMD患者房水中CSF1和CSF1R水平是否升高。
收集nAMD患者和ARC患者的房水，ELISA检测CSF1和CSF1R蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Millipore | 113-24-6 |
| 胎牛血清 | Merck | F8687 | |
| 青霉素-链霉素 | Millipore | 516106 | |
| 气体控制培养箱 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 重组人CSF1蛋白 | R&D Systems | 216-MC |
| 培昔达替尼（PLX3397） | Selleck Chemicals | S7818 | |
| CSF1中和抗体 | R&D Systems | MAB216 | |
| LY294002 | Selleck Chemicals | S1105 | |
| AS1842856 | Selleck Chemicals | S8222 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Sigma-Aldrich | 93289 |
| cDNA合成 | 高效cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| qRT-PCR | Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX试剂盒 | Invitrogen | 11744100 |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 增强化学发光底物 | ThermoFisher Scientific | 32106 | |
| ELISA | 人CSF1 ELISA试剂盒 | Invitrogen | EHCSF1 |
| 小鼠VEGF ELISA试剂盒 | R&D Systems | MMV00 | |
| 人p-CSF1R ELISA试剂盒 | Aviva Systems Biology | OKAG01687 | |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| EdU增殖实验 | EdU检测试剂盒（Alexa Fluor 594） | Millipore | 17-10527 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| 管形成实验 | 生长因子减少的Matrigel | BD Biosciences | 356230 |
| 动物实验 | Zoletil 50麻醉药 | Virbac | -- |
| Rompun麻醉药 | Bayer Healthcare | -- | |
| Mydriacyl散瞳药 | Wilson Ophthalmic Corporation | -- | |
| PASCAL二极管眼科激光系统 | Topcon Medical Laser Systems | -- | |
| 康柏西普 | Chengdu Kanghong Biotechnologies | -- | |
| 眼底血管造影 | 荧光素AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals | 17478025310 |
| 吲哚菁绿 | Merck | 1340009 | |
| 视网膜成像显微镜（Micron IV） | Phoenix Research Laboratories | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记的异凝集素B4 | ThermoFisher Scientific | I21411 |
| Alexa Fluor 568标记的CD31抗体 | Bioss Antibodies | bs-0468R-A594 | |
| Western blot | 抗CSF1抗体 | Proteintech | 14779-1-AP |
| 抗p-CSF1R (Y723)抗体 | Cell Signaling Technology | 3155 | |
| 抗CSF1R抗体 | Cell Signaling Technology | 3152 | |
| 抗p-PI3K (Y458)抗体 | Invitrogen | PA5-17387 | |
| 抗PI3K抗体 | Invitrogen | MA1-74183 | |
| 抗p-AKT (S473)抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4691 | |
| 抗p-FOXO1 (S256)抗体 | Cell Signaling Technology | 84192 | |
| 抗FOXO1抗体 | Cell Signaling Technology | 2880 | |
| 抗iNOS抗体 | Proteintech | 18985-1-AP | |
| 抗Arg1抗体 | Proteintech | 16001-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 统计分析 | SPSS软件 | -- | 15.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养条件 | HCVECs：缺氧条件为1% O2、94% N2、5% CO2；常氧为95% O2、5% CO2。培养基为DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素。巨噬细胞由人外周血单核细胞分化而来。 阅读提示：Materials and Methods, Cell Culture and Treatments |
| 药物处理 | CSF1重组蛋白（216-MC）浓度未明确；CSF1R抑制剂PLX3397（10 µM，24小时）；CSF1中和抗体（0.2 µg/mL，24小时）；LY294002（10 µM，24小时）；AS1842856（0.1 µM，24小时）。动物实验中PLX3397腹腔注射40 mg/kg，conbercept玻璃体腔注射1 µL（10 mg/mL）。 阅读提示：Materials and Methods, Cell Culture and Treatments; Mouse Laser-Induced CNV Model and Treatments |
| 共培养系统 | HCVECs与巨噬细胞共培养时的比例、培养基、处理时间等未明确。 阅读提示：Materials and Methods, Cell Culture and Treatments; Figure 2-4 legends |
| 动物模型 | C57BL/6J小鼠，6-8周龄，雄性。激光诱导CNV参数：532 nm，光斑直径200 µm，时间20 ms，功率120 mW，每眼4个光斑。分组包括正常、CNV 7天、CNV 7天+PBS、CNV 7天+CSF1中和抗体、CNV 7天+PLX3397、CNV 7天+conbercept。每个分组16只小鼠，排除出血的3只。 阅读提示：Materials and Methods, Mouse Laser-Induced CNV Model and Treatments |
| 临床样本 | nAMD患者10例，ARC患者10例。房水样本200 µL，采集后-80°C保存。ELISA检测CSF1和CSF1R。 阅读提示：Materials and Methods, Patient Subjects; Aqueous Humor Collection |
| 关键检测指标 | 信号通路蛋白磷酸化水平（p-CSF1R、p-PI3K、p-AKT、p-FOXO1）；巨噬细胞极化标志物（iNOS、Arg1）；血管生成功能（增殖、迁移、管形成）；体内CNV渗漏（FFA分级）、面积（ICGA）、体积（choroidal flat mounts）。 阅读提示：Materials and Methods, Western Blot; Real-Time RT-PCR; Transwell Migration Assay; EdU; Tube Formation; Fundus Angiography; Immunohistochemistry on Choroidal Flat-Mounts |