生育力分析
评估MYO6缺失对雄性小鼠生殖功能的影响
比较sv/+和sv/sv雄性小鼠与sv/+雌性交配后的平均产仔数
Myosin VI maintains the actin-dependent organization of the tubulobulbar complexes required for endocytosis during mouse spermiogenesis†‡
包含体外生化实验(免疫共沉淀、免疫印迹)、免疫荧光和免疫金电镜定位、以及MYO6敲除小鼠体内功能验证,多个证据层级相互支撑。
Snell's waltzer敲除小鼠(sv/sv)睾丸 对照杂合小鼠(sv/+)睾丸 VII期精子细胞/支持细胞上皮片段
MYO6抗体特异性经Western blot验证 sv/sv小鼠与sv/+对照为同窝配对 每组雄性小鼠数(sv/+ n=14, sv/sv n=16) 免疫金标记使用蛋白A金颗粒(10nm和15nm) 统计采用非配对双尾Student's t检验,P<0.05为显著
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估MYO6缺失对雄性小鼠生殖功能的影响
比较sv/+和sv/sv雄性小鼠与sv/+雌性交配后的平均产仔数
确定MYO6及其潜在结合蛋白在TBCs中的亚细胞定位
使用免疫荧光和免疫金电镜对sv/+睾丸进行MYO6、GIPC1、TOM1/L2、APPL1、VPS35等蛋白的定位分析
验证MYO6与GIPC1、TOM1/L2在睾丸中的物理相互作用
使用抗MYO6抗体进行免疫共沉淀,并通过免疫印迹检测GIPC1和TOM1/L2
评估MYO6缺失对TBCs肌动蛋白细胞骨架和早期内体分布的影响
对sv/sv睾丸进行免疫荧光染色,分析APPL1、TOM1/L2、GIPC1、VPS35、F-actin、Arp3和cortactin的分布,并量化异常TBC结构的比例
评估MYO6缺失是否影响TBCs对细胞连接蛋白的内吞作用
对sv/+和sv/sv VII期精子细胞进行nectin-3和F-actin的免疫荧光共定位分析
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光 | 抗APPL1抗体 | Proteintech | 12639-1-AP |
| 免疫荧光、免疫金、免疫印迹 | 抗TOM1L2抗体 | Abcam | ab96320 |
| 免疫荧光、免疫印迹 | 抗GIPC1抗体 | Proteintech | 14822-1-AP |
| 免疫荧光 | 抗Arp3抗体 | Sigma-Aldrich | A5979 |
| 抗cortactin抗体 | Millipore | 05-180 | |
| 抗PVRL3/nectin-3抗体 | Proteintech | 11213-1-AP | |
| 免疫印迹 | 抗肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2066 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488 鬼笔环肽 | Invitrogen | -- |
| Hoechst 33342 | Thermo Scientific | -- | |
| 免疫金 | 蛋白A金偶联物 | Department of Cell Biology, University of Utrecht | -- |
| 样本制备 | 多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片 | -- | -- |
| 免疫金 | LR Gold树脂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫印迹 | cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| Bio-Rad DC蛋白测定 | Bio-Rad | -- | |
| Amersham PVDF Hybond-P膜 | GE Healthcare | -- | |
| Amersham ECL Advance Western印迹检测试剂盒 | GE Healthcare | -- | |
| 免疫共沉淀 | 蛋白A-Sepharose CL-4B | GE Healthcare | -- |
| Clean-Blot IP检测试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| 显微镜 | 蔡司Axio Imager.Z2直立显微镜 | Zeiss | -- |
| 蔡司LSM 880激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| 徕卡TCS SP8激光扫描显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫金 | FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin透射电子显微镜 | FEI | -- |
| 统计 | GraphPad Prism 6 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | Snell's waltzer小鼠(C57BL/6背景),3月龄,雄性,sv/+和sv/sv同窝配对 阅读提示:Materials and methods: Animals |
| 生育力分析 | sv/+雄性(n=14)和sv/sv雄性(n=16)与sv/+雌性交配,繁殖条件:稳定且无病原体环境,2年数据 阅读提示:Results: Male mice lacking MYO6 expression are sub-fertile; Figure 2A.b |
| 免疫荧光 | 固定:4%甲醛,4°C过夜;封闭:1% BSA/PBS, 0.1% Triton X-100;一抗孵育4°C过夜;二抗孵育 阅读提示:Materials and methods: Preparation of epithelial fragments, Immunofluorescence studies |
| 免疫金电镜 | 固定:4%甲醛+0.25%戊二醛,4°C过夜;LR Gold树脂包埋;10nm/15nm蛋白A金颗粒 阅读提示:Materials and methods: Immunogold electron microscopy |
| 免疫共沉淀 | 裂解液:50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 5mM MgCl2, 1% NP-40, 5mM ATP;抗MYO6抗体5μg 阅读提示:Materials and methods: Co-immunoprecipitation |
| 统计 | 每组至少3次独立实验,数据以均值±SEM表示,非配对双尾Student's t检验,P<0.05为显著 阅读提示:Materials and methods: Statistical analysis |