肌球蛋白VI在小鼠精子发生过程中维持管状球状复合物的肌动蛋白依赖性组织,该复合物是内吞作用所必需的

Myosin VI maintains the actin-dependent organization of the tubulobulbar complexes required for endocytosis during mouse spermiogenesis†‡

作者信息Przemysław Zakrzewski, Anna Suwińska, Robert Lenartowski, Maria Jolanta Rędowicz, Folma Buss, Marta Lenartowska
PMID31901088
发布时间2020-04-15
DOI10.1093/biolre/ioz232

实验完整度

包含体外生化实验(免疫共沉淀、免疫印迹)、免疫荧光和免疫金电镜定位、以及MYO6敲除小鼠体内功能验证,多个证据层级相互支撑。

主要模型

Snell's waltzer敲除小鼠(sv/sv)睾丸 对照杂合小鼠(sv/+)睾丸 VII期精子细胞/支持细胞上皮片段

重点核对

MYO6抗体特异性经Western blot验证 sv/sv小鼠与sv/+对照为同窝配对 每组雄性小鼠数(sv/+ n=14, sv/sv n=16) 免疫金标记使用蛋白A金颗粒(10nm和15nm) 统计采用非配对双尾Student's t检验,P<0.05为显著

摘要

肌球蛋白VI(MYO6)是一种基于肌动蛋白的运动蛋白,已被认为参与多种细胞过程,包括内吞作用和肌动蛋白动力学的调节。MYO6在果蝇精子发生的最后一步中对肌动蛋白/膜重塑至关重要,MYO6缺陷的雄性果蝇不育。该蛋白也定位于参与小鼠精子发生的富含肌动蛋白的结构。尽管Snell's waltzer敲除(KO)小鼠中MYO6的缺失导致多种缺陷并显示雄性生育力降低,但尚未有研究探讨MYO6在小鼠精子发育中的作用。在此,我们证明MYO6及其一些结合伴侣存在于高度特化的基于肌动蛋白的结构——顶端管状球状复合物(TBCs),该复合物介导支持细胞-精子细胞界面处细胞间连接的内吞作用,这是精子释放所必需的过程。使用电子和光学显微镜以及生化方法,我们显示MYO6、GIPC1和TOM1/L2在睾丸中形成复合物,并主要定位于TBCs的一个早期内吞APPL1阳性区室,该区室不同于EEA1阳性早期内体。这些蛋白也与TBC无肌动蛋白的球状区域相关。最后,我们使用Snell's waltzer雄性睾丸的研究表明,MYO6的缺失导致肌动蛋白细胞骨架的破坏和TBCs的紊乱,并导致MYO6阳性早期APPL1-内体分布缺陷。综上所述,我们首次报道小鼠睾丸中MYO6的缺失降低了雄性生育力,并在精子发生的后期破坏了TBC相关内吞区室的空间组织。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
MYO6在小鼠精子发生后期是否以及如何影响TBCs的结构和功能?
核心机制
MYO6通过与GIPC1和TOM1/L2形成复合物,维持TBCs相关的APPL1阳性早期内体的空间组织,并可能通过调节Arp3和cortactin等肌动蛋白结合蛋白的分布来稳定TBCs的肌动蛋白细胞骨架。
主要证据
免疫荧光显示MYO6、GIPC1、TOM1/L2共定位于APPL1阳性囊泡;免疫共沉淀验证了MYO6与GIPC1、TOM1/L2的相互作用;免疫金电镜显示MYO6和TOM1/L2主要位于TBCs球部;sv/sv小鼠中APPL1、TOM1/L2、GIPC1和肌动蛋白结构分散,生育力降低约26%。
研究意义
首次报道MYO6在小鼠睾丸中的缺失降低雄性生育力并破坏精子发生后期TBC相关内吞区室的空间组织,提示MYO6在哺乳动物精子发生中可能具有结构作用。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生育力分析

评估MYO6缺失对雄性小鼠生殖功能的影响

比较sv/+和sv/sv雄性小鼠与sv/+雌性交配后的平均产仔数

2

MYO6及其结合伴侣的定位分析

确定MYO6及其潜在结合蛋白在TBCs中的亚细胞定位

使用免疫荧光和免疫金电镜对sv/+睾丸进行MYO6、GIPC1、TOM1/L2、APPL1、VPS35等蛋白的定位分析

3

蛋白复合物验证

验证MYO6与GIPC1、TOM1/L2在睾丸中的物理相互作用

使用抗MYO6抗体进行免疫共沉淀,并通过免疫印迹检测GIPC1和TOM1/L2

4

MYO6缺失对TBCs结构的影响

评估MYO6缺失对TBCs肌动蛋白细胞骨架和早期内体分布的影响

对sv/sv睾丸进行免疫荧光染色,分析APPL1、TOM1/L2、GIPC1、VPS35、F-actin、Arp3和cortactin的分布,并量化异常TBC结构的比例

5

nectin-3定位分析

评估MYO6缺失是否影响TBCs对细胞连接蛋白的内吞作用

对sv/+和sv/sv VII期精子细胞进行nectin-3和F-actin的免疫荧光共定位分析

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证蛋白相互作用
评估体内效果
数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗APPL1抗体Proteintech12639-1-AP
抗TOM1L2抗体Abcamab96320
抗GIPC1抗体Proteintech14822-1-AP
抗Arp3抗体Sigma-AldrichA5979
抗cortactin抗体Millipore05-180
抗PVRL3/nectin-3抗体Proteintech11213-1-AP
抗肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA2066
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽Invitrogen--
Hoechst 33342Thermo Scientific--
蛋白A金偶联物Department of Cell Biology, University of Utrecht--
多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片----
LR Gold树脂Sigma-Aldrich--
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物Roche--
Bio-Rad DC蛋白测定Bio-Rad--
Amersham PVDF Hybond-P膜GE Healthcare--
Amersham ECL Advance Western印迹检测试剂盒GE Healthcare--
蛋白A-Sepharose CL-4BGE Healthcare--
Clean-Blot IP检测试剂Thermo Scientific--
蔡司Axio Imager.Z2直立显微镜Zeiss--
蔡司LSM 880激光扫描显微镜Zeiss--
徕卡TCS SP8激光扫描显微镜Leica--
FEI Tecnai G2 Spirit BioTwin透射电子显微镜FEI--
GraphPad Prism 6----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型
Snell's waltzer小鼠(C57BL/6背景),3月龄,雄性,sv/+和sv/sv同窝配对
阅读提示:Materials and methods: Animals
生育力分析
sv/+雄性(n=14)和sv/sv雄性(n=16)与sv/+雌性交配,繁殖条件:稳定且无病原体环境,2年数据
阅读提示:Results: Male mice lacking MYO6 expression are sub-fertile; Figure 2A.b
免疫荧光
固定:4%甲醛,4°C过夜;封闭:1% BSA/PBS, 0.1% Triton X-100;一抗孵育4°C过夜;二抗孵育
阅读提示:Materials and methods: Preparation of epithelial fragments, Immunofluorescence studies
免疫金电镜
固定:4%甲醛+0.25%戊二醛,4°C过夜;LR Gold树脂包埋;10nm/15nm蛋白A金颗粒
阅读提示:Materials and methods: Immunogold electron microscopy
免疫共沉淀
裂解液:50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 5mM MgCl2, 1% NP-40, 5mM ATP;抗MYO6抗体5μg
阅读提示:Materials and methods: Co-immunoprecipitation
统计
每组至少3次独立实验,数据以均值±SEM表示,非配对双尾Student's t检验,P<0.05为显著
阅读提示:Materials and methods: Statistical analysis