构建Sertoli细胞特异性Uxt敲除小鼠
研究UXT在Sertoli细胞中的生理功能
通过将UxtF/Y雄性小鼠与Amh-Cre雌性小鼠杂交，获得Sertoli细胞特异性删除Uxt的KO小鼠及其对照WT小鼠。
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Sertoli细胞中的UXT是血睾屏障完整性所必需的
UXT in Sertoli cells is required for blood-testis barrier integrity†
实验完整度
高包含条件敲除小鼠模型、组织学、免疫荧光、RNA-seq、qPCR、透射电镜及生物素示踪等多种独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Sertoli细胞特异性Uxt敲除小鼠（UxtF/Y; Amh-Cre） tdTomato报告基因标记Sertoli细胞的小鼠
重点核对
Sertoli细胞特异性Uxt敲除小鼠的构建（UxtF/Y与Amh-Cre杂交） Uxt删除效率：部分Sertoli细胞仍表达UXT CLDN11蛋白水平下降且BTB处表达不连续 BTB通透性通过生物素示踪实验验证 电镜观察Sertoli细胞间连接间隙
摘要
精子发生是一个复杂的过程，它确立了男性生育能力，并涉及生殖系（精子）与体细胞组织（Sertoli细胞）之间的适当通讯。许多对精子产生重要的因素也是Sertoli细胞功能所必需的。最近，我们发现转录共辅因子普遍表达转录本（UXT）编码一种在生殖细胞中对精子发生和生育能力至关重要的蛋白质。然而，UXT在Sertoli细胞内的作用以及它如何影响Sertoli细胞功能仍不清楚。在这里，我们描述了UXT在Sertoli细胞支持精子发生能力中的新作用。我们发现，在Sertoli细胞中条件性删除Uxt会导致睾丸大小和重量减小，这与一部分生精小管中生殖细胞的丢失相吻合。此外，Uxt的删除对Sertoli细胞的丰度或成熟度没有影响，因为它们表达成熟Sertoli细胞的标记物。基因表达分析揭示，在Sertoli细胞中删除Uxt会降低参与血睾屏障（BTB）紧密连接的基因的转录。此外，示踪实验和电子显微镜显示，UXT KO动物的BTB是可渗透的。这些发现拓宽了我们对UXT在Sertoli细胞中的作用及其对BTB结构完整性贡献的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- UXT在Sertoli细胞中对精子发生和血睾屏障（BTB）完整性有何作用？
- 核心机制
- Sertoli细胞中UXT的缺失导致BTB紧密连接蛋白（包括CLDN11）表达下调，从而破坏BTB的完整性，使其通透性增加，进而导致生殖细胞丢失。
- 主要证据
- Sertoli细胞特异性Uxt敲除小鼠显示睾丸减小、生殖细胞丢失；RNA-seq和qPCR显示细胞粘附分子（如Cldn11）下调；免疫荧光显示CLDN11蛋白减少且不连续；电镜显示细胞连接间隙；生物素示踪显示BTB通透。
- 研究意义
- 首次揭示UXT在Sertoli细胞中作为转录调控因子调控BTB完整性，为理解精子发生及男性不育提供了新的机制见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析睾丸形态和生殖细胞丢失
评估Uxt缺失对精子发生的影响
观察2月龄WT和KO小鼠的睾丸大小和重量；通过PAS染色组织学检查，统计受影响的小管数量；免疫荧光检测UXT和Vimentin（Sertoli细胞标记）及TRA98（生殖细胞标记）。
评估Sertoli细胞活力和成熟度
确定Uxt缺失是否影响Sertoli细胞的存活和成熟
利用tdTomato标记Sertoli细胞，统计每小管Sertoli细胞数量；通过免疫组化检测成熟标记物GATA-1和AR。
RNA-seq分析Sertoli细胞转录组
鉴定UXT调控的基因和信号通路
分离并培养原代Sertoli细胞，用慢病毒表达Cre重组酶以提高敲除效率，通过RNA-seq比较WT和KO的转录差异，并通过qPCR验证。
验证BTB紧密连接蛋白表达
确认RNA-seq中下调的紧密连接基因在蛋白水平的变化
通过免疫荧光检测CLDN5、JAM2和CLDN11在WT和KO睾丸中的表达。
评估BTB超微结构和通透性
确定Uxt缺失是否导致BTB结构和功能异常
通过透射电镜观察细胞连接的超微结构；通过生物素示踪实验检测BTB的通透性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 饲养与繁殖 | Amh-Cre小鼠 | Jackson Laboratory | 129S.FVB-TG |
| Rosa26; Lox-stop-Lox tdTomato小鼠 | Jackson Laboratory | B6.Cg-Gt | |
| 免疫荧光 | 抗UXT抗体 | -- | 2361 |
| 波形蛋白抗体 | Abcam | Ab194719 | |
| 链霉亲和素，Alexa Fluor 555偶联物 | Invitrogen | S21381 | |
| 抗少突胶质细胞特异性蛋白抗体（CLDN11） | Abcam | Ab53041 | |
| TRA98抗体 | Abcam | Ab82527 | |
| 山羊抗大鼠IgG（H + L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| 山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21244 | |
| 山羊抗兔IgG（H + L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21428 | |
| ERK 1抗体（K-23） | Santa Cruz Biotechnology | sc-94 | |
| ECL兔IgG，HRP连接全抗体 | Millipore Sigma | NA934 | |
| GATA-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3535 | |
| AR（N-20）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5093 | |
| 组织处理 | Vector H-3300抗原修复液 | Vector | H-3300 |
| 正常山羊血清 | Vector Labs | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | SouthernBiotech | -- | |
| 成像 | EVOS FL Auto数字倒置荧光系统 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | -- | -- | |
| 透明质酸酶 | -- | -- | |
| 马血清 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 慢病毒感染 | 含Cre和嘌呤霉素选择标记的慢病毒载体 | Addgene | 17408 |
| RNA提取 | RNeasy Plus微型试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq | TruSeq链式mRNA LT试剂盒 | Illumina | RS-122-2101 |
| Illumina 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA质量评估 | Agilent生物分析仪 | Agilent | -- |
| 样品制备 | Beckman Biomek FX仪器 | Beckman | -- |
| 透射电镜 | EMbed 812环氧树脂 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| Philips CM-12电子显微镜 | Philips | -- | |
| Gatan（4k×2.7k）数字相机 | Gatan | -- | |
| BTB通透性实验 | EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | Thermo Scientific | 21335 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Sertoli细胞特异性Uxt敲除小鼠的构建 | 小鼠品系：UxtF/Y雄性与Amh-Cre雌性（129S.FVB-TG (AMH-cre) 8815REB/）杂交；基因型鉴定 阅读提示：Materials and methods: Generating UxtF/Y; AMH-Cre mice |
| 睾丸形态和组织学分析 | 小鼠周龄（2个月）；睾丸重量测量（N=10）；PAS染色流程：Bouin固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片厚度（5μm） 阅读提示：Results: Sertoli cell deletion of UXT impairs spermatogenesis; Materials and methods: Histology |
| 免疫荧光和免疫组化 | 抗体（表1）的稀释比例；抗原修复方法（Vector H-3300，微波20min）；封片剂（Fluoromount-G） 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence; Table 1 |
| Sertoli细胞分离和培养 | 酶消化条件（第一次：1mg/ml胶原酶和4mg/ml DNase，37°C，150RPM，4min；第二次：1mg/ml胶原酶，0.5mg/ml胰蛋白酶，1.5mg/ml透明质酸酶，4mg/ml DNase，37°C，150RPM，8min）；过滤（70μm）；离心（300×g，8min）；培养条件（DMEM/F12+5%马血清+2.5%胎牛血清，24h后无血清培养24h） 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and sequencing |
| 慢病毒感染和选择 | 感染方案（两次连续感染）；嘌呤霉素浓度和筛选时间（1周）；KO细胞用含Cre和嘌呤霉素选择标记的载体（Addgene #17408） 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and sequencing |
| RNA-seq | 文库构建试剂盒（Illumina TruSeq Stranded mRNA LT）；测序平台（Illumina 2500，v4 chemistry，单端50bp）；RNA输入量（250ng）；PCR循环数（12） 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and sequencing |
| RNA-seq数据分析 | 分析平台（Rosalind）；比对软件（STAR，mm10）；定量软件（HTseq）；差异分析（DESeq2）；阈值（P≤0.05，1.5 log2 fold change） 阅读提示：Materials and methods: RNA-Seq analysis |
| 透射电镜 | 固定液（2.5%戊二醛和2%多聚甲醛）；后固定（2%四氧化锇1h）；包埋剂（EMbed 812）；切片厚度（70nm） 阅读提示：Materials and methods: Transmission electron microscopy |
| BTB通透性实验 | 示踪剂（EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin，557Da，Thermo Scientific #21335）；注射方式和剂量（文中未明确说明）；观察时间（文中未明确说明） 阅读提示：Materials and methods: Biotin tracer studies |