验证TRIM33对DC稳态的影响
确定TRIM33缺失是否影响DC亚群的数量和稳态。
利用Itgax-Cre和Cre-ERT2条件性敲除小鼠，通过流式细胞术分析脾脏、胸腺、淋巴结中DC亚群的数量。
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TRIM33通过调控Irf8和Bcl2l11转录在树突状细胞分化和稳态中发挥关键作用
TRIM33 plays a critical role in regulating dendritic cell differentiation and homeostasis by modulating Irf8 and Bcl2l11 transcription
实验完整度
高包含细胞系、原代细胞、小鼠模型、骨髓嵌合体和多种组学分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠骨髓来源的DC及其祖细胞 Trim33fl/flCre-ERT2小鼠模型 DC2.4细胞系 Mutu DC1940细胞系
重点核对
TRIM33在DC分化中的作用通过多种条件性敲除小鼠模型进行验证 TRIM33与CDK9的相互作用通过免疫共沉淀和CUT&Tag验证 TRIM33对Irf8和Bcl2l11的转录调控通过ChIP-qPCR和RNA-seq验证 Bcl2l11敲低和Irf8过表达的回补实验验证其在DC分化中的功能
摘要
不同树突状细胞(DC)亚群，即浆细胞样DC(pDCs)和常规DC亚群(cDC1s和cDC2s)的发育受特定转录因子控制。IRF8对cDC1的命运决定至关重要。然而，Irf8的表达如何被调控尚不完全清楚。在本研究中，我们确定了TRIM33是DC分化和维持的关键调控因子。在Trim33fl/fl Cre-ERT2小鼠中敲除TRIM33显著损害了造血祖细胞在不同发育阶段的DC分化。TRIM33缺陷下调了这些祖细胞中多个与DC分化相关的基因的表达。TRIM33通过维持Irf8基因位点上足够的CDK9和Ser2磷酸化RNA聚合酶II(S2 Pol II)水平，促进Irf8的转录，从而促进cDC1的分化。此外，TRIM33通过直接抑制PU.1介导的Bcl2l11转录，阻止DC和祖细胞的凋亡，从而维持DC稳态。总之，我们的发现确定了TRIM33通过调节Irf8和Bcl2l11表达，作为DC分化和维持的新型关键调控因子。TRIM33作为DC分化和存活的关键调控因子的发现，为设计基于DC的免疫干预和疗法提供了潜在益处。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM33在树突状细胞分化和稳态维持中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- TRIM33通过维持Irf8基因位点上CDK9和S2 Pol II的水平促进Irf8转录，并通过与PU.1共定位抑制Bcl2l11转录，从而分别促进cDC1分化和维持DC存活。
- 主要证据
- 通过小鼠模型、细胞系、RNA-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR等实验证明TRIM33调控Irf8和Bcl2l11表达，且Bcl2l11敲低和Irf8过表达能部分恢复DC分化。
- 研究意义
- 研究揭示TRIM33是调控DC分化和存活的关键因子，为基于DC的免疫干预和疗法提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证TRIM33在DC发育中的细胞内在作用
确定TRIM33对DC发育的影响是否源于造血细胞本身。
通过骨髓嵌合小鼠实验，将CD45.2 WT或cKO骨髓细胞与CD45.1 WT骨髓细胞混合移植到致死辐照的CD45.1受体中，然后通过流式细胞术分析供体来源的DC亚群。
评估TRIM33对DC祖细胞分化的影响
确定TRIM33缺失是否影响各种造血祖细胞的DC生成能力。
从WT和KO小鼠骨髓中分选MPPs、CMPs、CLPs、CD115+CDPs和CD115–CDPs，在Flt3L培养体系中诱导DC分化，并在不同时间点分析生成的DC亚群。
转录组分析TRIM33调控的基因
鉴定TRIM33缺失导致表达改变的基因，特别是DC相关基因。
对WT和KO的MPPs、CLPs和CD115–CDPs进行RNA-seq，分析差异表达基因，并通过qPCR验证关键基因。
研究TRIM33的染色质结合谱
确定TRIM33在基因组上的结合位点及其与CDK9、S2 Pol II、PU.1等因子的共定位。
使用CUT&Tag技术对WT CDPs进行TRIM33、CDK9、S2 Pol II的全基因组结合分析，并整合公共数据集（ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、PU.1 ChIP-seq）进行比较。
验证TRIM33对Irf8转录的调控机制
验证TRIM33是否通过影响CDK9和S2 Pol II在Irf8位点的结合来促进Irf8转录。
通过ChIP-qPCR分析WT和KO BM Lin–细胞中TRIM33、CDK9、S2 Pol II在Irf8启动子、基因体和增强子区域的结合。
研究TRIM33对DC存活的调控
确定TRIM33是否通过抑制Bcl2l11表达来维持DC存活。
通过Annexin V/7-AAD染色评估TRIM33缺陷DC的凋亡情况，并通过Western blot检测凋亡相关蛋白。同时检测Bcl2l11的表达水平。
评估Bcl2l11敲低对TRIM33缺陷DC存活的恢复作用
验证Bcl2l11抑制是否能恢复TRIM33缺陷细胞的存活。
在DC2.4细胞中通过shRNA敲低Bcl2l11，然后检测细胞存活率。
验证Irf8过表达和Bcl2l11敲低对cDC1生成的协同作用
确定Irf8过表达和Bcl2l11敲低是否能协同恢复TRIM33缺陷细胞的cDC1生成。
在BM Lin–细胞中同时转导Irf8过表达和Bcl2l11 shRNA，然后在Flt3L培养体系中检测cDC1的生成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648-1G |
| 细胞培养 | Flt3配体 | Peprotech | 96-250-31L-10 |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 315-03-100 | |
| ODN 2216 | InvivoGen | tlrl-2216-5 | |
| 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | P9582-5MG | |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630-10MG | |
| 干细胞因子 | PeproTech | 250-03 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| IMDM培养基 | HyClone | SH30228.01 | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 细胞分离 | 胶原酶III | Worthington Biochemical | CLS-3 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10-104-159-001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | -- | |
| BioMag免疫磁珠 | Bangs Laboratories | BM560 | |
| 抗CD16/32抗体 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V | BioLegend | -- |
| 7-AAD | BioLegend | -- | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| BD AriaIII分选仪 | BD | -- | |
| 基因修饰 | 聚凝胺 | Macgene | -- |
| RetroNectin | Takara | T100B | |
| RNA提取 | TRIzol | Invitrogen | 15596018 |
| RT-qPCR | PrimeScript RT预混液 | Takara | RR036A |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | A25742 | |
| 7900HT快速实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫沉淀 | Western和IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 抗TRIM33抗体 | Bethyl Laboratories | A301-059A | |
| 对照IgG | Cell Signaling Technology | 2729 | |
| Protein A+G磁珠 | Millipore | 16-663 | |
| 抗CDK9抗体 | Abcam | ab239364 | |
| 蛋白质印迹 | PVDF膜 | -- | -- |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34578 | |
| Amersham Imager 600成像系统 | GE | -- | |
| 质谱 | LTQ Velos LTQ质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Thermo-Dionex Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Q Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive原位ChIP文库制备试剂盒 | Vazyme | -- |
| ChIP | ChIP-IT Express酶切试剂盒 | Active Motif | 53035 |
| Magna ChIP Protein A+G磁珠 | Millipore | 16-663 | |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| 测序 | BGISEQ-500测序平台 | BGI | -- |
| HiSeq X测序平台 | Illumina | -- | |
| NovoSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：Trim33fl/fl、Cre-ERT2、Itgax-Cre；他莫昔芬剂量：2 mg/天，连续5天；处理时间：7天后分析 阅读提示：Materials and methods: Animals |
| 细胞培养 | Flt3L浓度：200 ng/mL；4-OHT浓度：1 μM；培养时间：4-9天；细胞密度：1.5-3×10^6/mL 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 流式细胞术 | 抗体信息：Table S6；Annexin V和7-AAD染色步骤；细胞内染色固定/透化试剂盒 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry |
| 基因修饰 | shRNA序列：Bcl2l11 shRNA (GACGAGTTCAACGAAACTTAC)；Irf8过表达载体：pMYs-IRES-GFP；转导方法：RetroNectin包被板 阅读提示：Materials and methods: Genetic modifications through viral transduction |
| 分子实验 | ChIP-qPCR抗体：抗TRIM33、抗CDK9、抗S2 Pol II；CUT&Tag试剂盒：Vazyme；RNA-seq平台：BGISEQ-500 阅读提示：Materials and methods: CUT&Tag, chromatin immunoprecipitation assays, sequencing, and data analysis |