体内验证MYO1F在T细胞活化中的作用
探究MYO1F在T细胞中缺失对体内抗肿瘤免疫和自身免疫反应的影响。
建立MC38和B16皮下肿瘤模型及B16转移模型，比较T细胞特异性Myo1f敲除小鼠与对照小鼠的肿瘤生长、转移和T细胞浸润；诱导EAE模型，评估临床评分和病理变化。
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MYO1F通过促进GAPDH乙酰化调控T细胞活化和糖酵解代谢
MYO1F regulates T-cell activation and glycolytic metabolism by promoting the acetylation of GAPDH
实验完整度
高包含体外细胞实验、小鼠肿瘤模型、EAE模型、患者样本分析等多个独立证据层级，并有功能验证（敲除/过表达）和机制验证（磷酸化、乙酰化修饰）。
主要模型
T细胞特异性Myo1f敲除小鼠 hVAV1-MYO1F敲入小鼠 Jurkat细胞 人PTCL患者样本
重点核对
T细胞特异性Myo1f敲除小鼠的构建方式（LCK-Cre） 抗CD3/CD28刺激浓度（2 μg/mL）及时间（5小时） GAPDH活性测定试剂盒（ab204732，Abcam） KA给药剂量（1 mg/kg，腹腔注射） 患者样本中MYO1F-VAV1融合基因检测方法
摘要
T细胞中适当的细胞代谢对于有效的免疫反应至关重要。然而，当受到内在或外在代谢因素的失调时，T细胞可能导致多种疾病，如癌症和自身免疫性疾病。然而，T细胞的代谢调控仍未被完全理解。在此，我们表明MYO1F是TCR刺激后人和小鼠T细胞活化所必需的，并且T细胞特异性Myo1f基因敲除小鼠表现出肿瘤负荷增加和EAE严重程度减轻，这是由于体内T细胞活化受损。机制上，在TCR刺激后，LCK在酪氨酸607和634位点磷酸化MYO1F，这对由乙酰转移酶α-TAT1介导的GAPDH在Lys84、86和227位点的乙酰化至关重要，这些过程对其活化、细胞糖酵解以及T细胞的效应功能很重要。重要的是，我们表明VAV1-MYO1F融合蛋白（一种复发性外周T细胞淋巴瘤（PTCL）相关的致癌蛋白）促进GAPDH的过度乙酰化及其活化，导致异常的糖酵解和T细胞增殖，并且抑制GAPDH的活性显著限制T细胞活化和增殖，并延长hVAV1-MYO1F敲入小鼠的生存期。此外，在含有VAV1-MYO1F基因融合的人PTCL患者样本中证实了GAPDH的过度乙酰化。总之，这项研究不仅揭示了MYO1F调节T细胞代谢和VAV1-MYO1F融合诱导的PTCL的机制，也为PTCL的治疗提供了有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MYO1F如何调控T细胞活化和代谢，以及VAV1-MYO1F融合蛋白如何驱动PTCL肿瘤发生？
- 核心机制
- TCR刺激后，LCK磷酸化MYO1F的Tyr607/Tyr634，促进MYO1F招募α-TAT1，进而乙酰化GAPDH的Lys84/86/227，增强GAPDH酶活性和糖酵解，促进T细胞活化；VAV1-MYO1F融合蛋白通过增强与α-TAT1的相互作用，导致GAPDH过度乙酰化和激活，引起T细胞过度活化和增殖，驱动PTCL。
- 主要证据
- 证实MYO1F与GAPDH直接结合，LCK磷酸化MYO1F的Y607/Y634是招募α-TAT1所必需的；MYO1F敲除导致GAPDH乙酰化、酶活性和T细胞活化降低；VAV1-MYO1F过表达增强T细胞活化和代谢；GAPDH抑制剂KA可抑制hVAV1-MYO1F敲入小鼠的T细胞活化和增殖并延长生存期；PTCL患者样本中VAV1-MYO1F融合阳性样本GAPDH乙酰化水平升高。
- 研究意义
- 揭示了MYO1F调控T细胞代谢和VAV1-MYO1F融合诱导PTCL的新机制，并提示GAPDH活性可能是PTCL的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证MYO1F在T细胞活化中的作用
验证MYO1F对人和小鼠T细胞活化和增殖的直接影响。
用siRNA敲低人T细胞中的MYO1F或使用Myo1f敲除小鼠的T细胞，用抗CD3/CD28刺激，检测IL-2产生、TCR信号通路蛋白磷酸化和增殖标志物；在Jurkat细胞中过表达MYO1F，观察活化标志。
鉴定MYO1F相互作用蛋白及验证GAPDH乙酰化
确定MYO1F调控T细胞活化的分子机制，特别是GAPDH乙酰化的作用。
通过免疫沉淀和质谱鉴定MYO1F相互作用蛋白；用免疫共沉淀、免疫荧光、PLA实验验证MYO1F与GAPDH的相互作用；检测MYO1F对GAPDH乙酰化水平和酶活性的影响。
确定GAPDH乙酰化位点及功能研究
验证GAPDH乙酰化位点（K84/86/227）对其酶活性和T细胞功能的重要性。
质谱鉴定乙酰化位点；构建GAPDH突变体（K84R、K86R、K227R、K3R），检测乙酰化水平、酶活性、与MYO1F结合以及T细胞活化和代谢。
验证LCK磷酸化MYO1F及其功能
验证LCK对MYO1F的磷酸化是否影响MYO1F与α-TAT1的结合以及下游GAPDH乙酰化。
通过免疫共沉淀验证MYO1F与LCK的相互作用；质谱鉴定LCK磷酸化的酪氨酸位点；构建Y2F突变体，检测磷酸化、与α-TAT1的结合、GAPDH乙酰化、T细胞活化和代谢。
研究VAV1-MYO1F融合蛋白对GAPDH乙酰化和T细胞代谢的影响
阐明VAV1-MYO1F融合蛋白如何驱动T细胞过度活化和PTCL。
比较VAV1-MYO1F融合蛋白与野生型MYO1F与α-TAT1和GAPDH的相互作用；检测GAPDH乙酰化水平、酶活性、T细胞活化和代谢；在hVAV1-MYO1F敲入小鼠中验证GAPDH抑制剂KA的治疗效果。
患者样本验证
验证人类PTCL样本中MYO1F-VAV1融合与GAPDH过度乙酰化的关联。
收集PTCL患者样本，检测MYO1F-VAV1融合基因，并通过免疫组化检测GAPDH乙酰化水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| T细胞分选 | EasySep™小鼠CD4+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19852 |
| EasySep™小鼠初始CD4+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19765 | |
| EasySep™小鼠初始CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19858 | |
| EasySep™小鼠CD8+ T细胞分选试剂盒 | STEMCELL | 19853 | |
| GAPDH活性测定 | GAPDH活性检测试剂盒 | Abcam | ab204732 |
| 免疫印迹 | 抗p-Zap-70抗体 | Cell Signaling Technology | 2717 |
| 抗Zap-70抗体 | Cell Signaling Technology | 3165 | |
| 免疫沉淀 | 抗HA抗体 | Sigma | H9658 |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 免疫印迹 | 抗MYO1F抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-376534 |
| 抗p-ERK抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-81492 | |
| 抗磷酸化酪氨酸抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-13524 | |
| 抗HSP90抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-130068 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-8432 | |
| 抗GAPDH抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-271269 | |
| 抗ERK抗体 | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY | sc-293335 | |
| 抗LCK抗体 | ABclonal | A2177 | |
| 抗Flag标签抗体 | ABclonal | AE024 | |
| 抗Myc标签抗体 | ABclonal | AE070 | |
| 抗p-Lck抗体（Y394） | R&D Systems | MAB7500 | |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | Abcam | ab21623 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100221 |
| 抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100405 | |
| 抗人CD4抗体 | BioLegend | 980802 | |
| 抗小鼠CD8抗体 | BioLegend | 100705 | |
| 抗人CD8抗体 | BioLegend | 980908 | |
| 抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103132 | |
| 抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101212 | |
| 抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123110 | |
| 抗小鼠Ly-6C抗体 | BioLegend | 128036 | |
| 抗小鼠Ly-6G抗体 | BioLegend | 127628 | |
| 抗小鼠B220抗体 | BioLegend | 102222 | |
| 抗小鼠IFN-γ抗体 | BioLegend | 505808 | |
| 抗人IFN-γ抗体 | BioLegend | 383303 | |
| 抗小鼠IL-17A抗体 | BioLegend | 506916 | |
| 抗小鼠CD69抗体 | BioLegend | 104513 | |
| 抗人CD69抗体 | BioLegend | 310910 | |
| 抗小鼠Ki-67抗体 | BioLegend | 652404 | |
| 抗人Ki-67抗体 | BioLegend | 350503 | |
| Zombie Violet细胞活力检测试剂盒 | BioLegend | 423114 | |
| 代谢分析 | Seahorse XF HS Mini细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞培养 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | -- | -- |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 葡萄糖 | -- | -- | |
| IV型胶原酶 | Sigma | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Biofroxx | -- | |
| 细胞过滤器 | Biologix Group Limited | -- | |
| 免疫组织化学 | DAB显色试剂盒 | BD Pharmingen | -- |
| Harris苏木素 | Fisher Scientific | -- | |
| EAE诱导 | MOG35-55肽 | -- | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Difco | -- | |
| 百日咳毒素 | -- | -- | |
| 体内处理 | 他莫昔芬 | -- | -- |
| 庚二酸 | -- | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| RfectSP siRNA转染试剂 | Biogenerating Biotechnology | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| RT-PCR | SuperScript® II逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SYBR Green实时定量PCR预混液 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 蔡司LSM 900显微镜 | Zeiss | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| 免疫沉淀 | A-Sepharose珠 | -- | -- |
| G-Sepharose珠 | -- | -- | |
| 质谱分析 | Agilent Zorbax 300SB-C18色谱柱 | Agilent | -- |
| Eskigent纳升液相色谱系统 | -- | -- | |
| Thermo LTQ-ETD-Orbitrap质谱仪 | Thermo | -- | |
| Advion Triversa nanomate纳喷雾源 | Advion | -- | |
| 生物信息学 | PyMOL软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体内动物模型 | 小鼠品系、基因敲除策略、肿瘤细胞系、注射剂量和途径、EAE诱导条件、KA给药剂量和方式 阅读提示：材料与方法：Mice、In vivo tamoxifen and KA treatment；图1、图6、补充图2 |
| T细胞分离与刺激 | 小鼠品系、组织来源、分选试剂盒、刺激抗体浓度和刺激时间 阅读提示：材料与方法：T-cell isolation and stimulation；图2、补充图4 |
| 分子相互作用与修饰验证 | 质粒构建、转染细胞系、抗体克隆号、免疫沉淀条件、质谱参数 阅读提示：材料与方法：Reagents、Immunoblotting and immunoprecipitation、Mass spectrometry；图3、图4、图5 |
| GAPDH活性与代谢分析 | 试剂盒品牌货号、细胞处理、ECAR检测设备及浓度设置 阅读提示：材料与方法：GAPDH activity measurement、ECAR；图3、图4、图6 |
| 患者样本分析 | 样本来源与数量、融合基因检测方法、IHC抗体和评分方法 阅读提示：材料与方法：Human PTCL sample study、Immunohistochemistry；图7 |