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        SENP6通过去SUMO化USP8限制IFN-I诱导的信号通路和抗病毒活性

        SENP6 restricts the IFN-I-induced signaling pathway and antiviral activity by deSUMOylating USP8

        作者信息Jing Guo, Hui Zheng, Sidong Xiong
        PMID38906982
        期刊Cell Mol Immunol
        发布时间2024-08
        DOI10.1038/s41423-024-01193-3
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        研究包含体外细胞系（293T、THP1、HeLa等）病毒染毒实验、小鼠体内siRNA敲低及VSV攻毒实验，以及免疫共沉淀、Western blot、RT-qPCR等分子机制验证，多层次证据链清晰。

        主要模型

        293T细胞 THP1细胞 HeLa细胞 MEF细胞（Ifnar1+/+和Ifnar1–/–） 小鼠模型（C57BL/6）

        重点核对

        SENP6敲低对VSV、SeV、HSV感染的影响（MOI=1.0，感染12-24小时） SENP6敲低对IFN-I诱导的ISG表达和JAK-STAT信号通路的影响（IFNα 1000 IU/ml处理8小时） SENP6敲低对IFNAR2蛋白水平和泛素化的影响（Western blot和免疫沉淀） USP8敲低逆转SENP6对IFNAR2泛素化的调节作用（siUSP8预处理） 体内实验中siSENP6注射小鼠对VSV感染的抵抗力（2×10^8 pfu/只）

        摘要

        I型干扰素（IFN-I）具有广谱抗病毒特性，临床上常用于治疗病毒感染。在本研究中，我们揭示了SENP6是IFN-I抗病毒活性的有效调节因子。SENP6不影响病毒诱导的IFN-I产生，而是调节IFN-I激活的信号传导。机制上，SENP6与USP8组成性相互作用，并抑制USP8的SUMO化，从而限制USP8与IFNAR2之间的相互作用。USP8与IFNAR2的解离增强了IFNAR2的泛素化和降解，从而减弱了IFN-I抗病毒活性。相应地，SENP6的下调促进了USP8与IFNAR2的相互作用，导致IFNAR2泛素化减少，从而增强IFN-I诱导的信号传导。本研究揭示了一种关键的去SUMO化-去泛素化串扰，精细调控病毒感染时的IFN-I应答。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        SENP6在病毒感染的IFN-I应答中扮演何种角色及其分子机制是什么？
        核心机制
        SENP6通过去SUMO化USP8，抑制USP8与IFNAR2的相互作用，从而促进IFNAR2的泛素化和降解，减弱IFN-I诱导的JAK-STAT信号通路和抗病毒活性；SENP6下调增强USP8的SUMO化，加强USP8与IFNAR2的结合，减少IFNAR2泛素化，增强IFN-I信号和抗病毒效应。
        主要证据
        研究发现SENP6敲低增强IFN-I诱导的ISG表达和抗病毒活性，并降低IFNAR2泛素化；SENP6与USP8相互作用并抑制其SUMO化，USP8与IFNAR2相互作用并减少其泛素化；体内实验显示sSENP6小鼠对VSV感染更具抵抗力。
        研究意义
        本研究揭示SENP6作为USP8的"分子刹车"，调控IFN-I信号和抗病毒活性，为增强IFN-I抗病毒治疗提供潜在靶点，加深对先天抗病毒防御的理解。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        病毒感染的细胞模型和SENP6表达变化分析

        验证病毒感染对SENP6蛋白水平的影响，并初步探究SENP6对病毒感染的调控作用。

        用VSV感染293T细胞，Western blot检测SENP6蛋白水平；在293T、THP1和HeLa细胞中过表达或敲低SENP6，感染VSV、SeV或HSV，检测病毒蛋白或RNA水平。

        2

        体内SENP6敲低对VSV感染的影响

        在动物水平验证SENP6下调对宿主抗病毒应答的影响。

        通过尾静脉注射SENP6 siRNA敲低小鼠肝脏SENP6，然后用VSV感染，监测存活率、肝脏病毒载量和ISG表达。

        3

        SENP6对IFN-I信号通路的影响

        确定SENP6是否调控IFN-I诱导的信号传导和ISG表达。

        在SENP6敲低或过表达的293T细胞中，用IFNα刺激，检测STAT1磷酸化、ISG表达和抗病毒活性；使用ML-792或ruxolitinib抑制剂验证机制。

        4

        机制探究：SENP6调控IFNAR2泛素化和降解

        探究SENP6影响IFN-I信号的分子机制，特别是对IFNAR2的调控。

        检测SENP6敲低对IFNAR2蛋白水平和泛素化的影响，以及SENP6是否与IFNAR2相互作用；使用DUB抑制剂PR-619或E1抑制剂PYR-41分析。

        5

        鉴定USP8为SENP6下游的DUB

        寻找SENP6调控IFNAR2泛素化所依赖的去泛素化酶。

        利用UbiBrowser预测IFNAR2的DUB，通过免疫共沉淀验证USP8与IFNAR2和SENP6的相互作用，并检测USP8对IFNAR2泛素化和稳定性的影响。

        6

        验证SENP6调节USP8的SUMO化及其功能意义

        揭示SENP6通过去SUMO化USP8调控其与IFNAR2的相互作用。

        检测SENP6敲低对USP8 SUMO化的影响，以及SUMO化对USP8-IFNAR2相互作用和IFNAR2泛素化的影响；构建SENP6截短突变体定位互作结构域。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        细胞培养与感染
        细胞培养病毒感染
        分子表达与修饰检测
        蛋白质印迹免疫共沉淀免疫荧光实时荧光定量PCR
        蛋白稳定性与泛素化分析
        放线菌酮追踪实验泛素化检测
        体内实验
        小鼠生存分析病毒载量检测

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养DMEM培养基HyClone--
        RPMI 1640培养基HyClone--
        胎牛血清GIBCO--
        药物处理重组人干扰素αPBL InterferonSource--
        MG132Sigma-Aldrich--
        APDCMedChemExpressHY-18738
        ML-792MedChemExpressHY-108702
        鲁索替尼MedChemExpressHY-50858
        PYR-41MedChemExpressHY-13296
        PR-619MedChemExpressHY-13814
        转染Longtrans转染试剂UcallM Biotechnology--
        Lipofectamine RNAiMAX转染试剂Invitrogen--
        原核蛋白表达Ni-NTA亲和树脂BBIC600033-0025
        RNA提取与PCRTRIzol试剂TAKARA--
        RT-qPCREasyScript一步法cDNA合成试剂盒TransGen BiotechAE311
        SYBR Green PCR预混液VazymeQ331-AA
        免疫印迹PVDF膜----
        免疫沉淀Protein G琼脂糖珠Millipore16-266
        anti-HA琼脂糖珠BimakeB26201
        anti-Flag琼脂糖珠BimakeB26102
        蛋白提取膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒BeyotimeP0033
        免疫荧光Hoechst 33342染料----
        抗体SENP6抗体Sigma-AldrichHPA024376
        SENP6抗体Affinity BiosciencesAF0277
        USP8抗体ABclonalA7031
        SUMO1抗体Abcamab32058
        SUMO2/3抗体SelleckchemA5199
        IFNAR1抗体ABclonalA18594
        IFNAR2抗体ABclonalA1769
        STAT1抗体Cell Signaling Technology9172
        pY701-STAT1抗体Cell Signaling Technology9167
        STAT2抗体Cell Signaling Technology72704
        pY690-STAT2抗体Cell Signaling Technology88410
        JAK1抗体Proteintech66466-1-lg
        pY1022/1023-JAK1抗体ABclonalAP0530
        Tyk2抗体Cell Signaling Technology14193
        pY1054/1055-Tyk2抗体Cell Signaling Technology9321
        VSV-G抗体Abcamab183497
        HA抗体ABclonalAE036
        Flag抗体Sigma-AldrichF7425
        Myc抗体Cell Signaling Technology9B11
        GAPDH抗体ABclonalAC033
        Na+/K+-ATPase α1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-514614

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        病毒感染
        VSV、SeV、HSV的MOI和感染时间；SENP6敲低或过表达的处理时间
        阅读提示：参见图1图注和病毒与感染部分
        IFN-I处理
        IFNα浓度和处理时间；细胞类型
        阅读提示：参见图3图注和细胞培养与试剂部分
        siRNA敲低
        siRNA序列、转染试剂和浓度；敲低效率验证
        阅读提示：参见质粒构建和转染部分及图1-6图注
        免疫沉淀
        细胞裂解液成分、抗体和珠子类型；洗涤条件；SUMO化和泛素化检测时的NEM处理
        阅读提示：参见免疫印迹和免疫沉淀部分
        小鼠实验
        小鼠品系和年龄；siRNA注射剂量和次数；VSV感染剂量；存活监测时间；器官采集时间
        阅读提示：参见小鼠和病毒感染体内部分及图2图注

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