鉴定STING相互作用蛋白
寻找TREX1缺陷介导的自身免疫中STING的潜在调控因子。
通过免疫沉淀联合质谱分析，鉴定与STING相互作用的E3泛素连接酶RNF115。
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双硫仑通过靶向RNF115改善STING/MITA依赖性炎症和自身免疫
Disulfiram ameliorates STING/MITA-dependent inflammation and autoimmunity by targeting RNF115
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型（Rnf115–/–Trex1–/–、Rnf115–/–STINGN153S/WT）、骨髓嵌合小鼠模型、体外细胞实验（GM-DCs/Macs、MLFs、MPMECs、PBMCs）及机制验证（泛素化、寡聚化、细胞内定位）。
主要模型
Trex1–/–小鼠 STINGN153S/WT小鼠及骨髓嵌合小鼠 骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞（GM-DCs/Macs） SLE患者外周血单个核细胞（PBMCs）
重点核对
RNF115敲除对Trex1–/–小鼠生存率和炎症因子水平的影响 RNF115敲除对STINGN153S/WT骨髓嵌合小鼠生存率和免疫细胞发育的影响 RNF115敲除或DSF处理对SLE患者PBMCs中IFN-α、IFN-γ和促炎细胞因子表达的抑制作用 RNF115敲除对STING和STINGN153S K63链接泛素化、寡聚化及高尔基体定位的影响 DSF处理对Trex1–/–小鼠和NS→WT嵌合小鼠自身免疫表型的改善作用
摘要
STING（也称为MITA）是一种衔接蛋白，介导胞质DNA触发的信号传导，胞质自身DNA或功能获得性突变导致的STING/MITA异常激活会引起严重炎症。在这里，我们展示了STING介导的炎症和自身免疫由RNF115促进，并由RNF115抑制剂双硫仑（DSF）缓解。敲除RNF115或DSF治疗可显著抑制Trex1–/–小鼠和STINGN153S/WT骨髓嵌合小鼠的全身性炎症和自身免疫致死性，并恢复免疫细胞发育。此外，敲低或药理学抑制RNF115可显著下调外周血dsDNA浓度高的系统性红斑狼疮（SLE）患者PBMCs中IFN-α、IFN-γ和促炎细胞因子的表达。机制上，敲除或抑制RNF115会损害多种cGAMP转染细胞以及Trex1–/–小鼠器官和细胞中STING的寡聚化和高尔基体定位。有趣的是，敲除RNF115抑制了髓系细胞中STINGN153S的激活和高尔基体定位以及促炎细胞因子的表达，但在内皮细胞或成纤维细胞中则不然。总之，这些发现强调了RNF115介导的STING和STINGN153S的细胞类型特异性调节，并为STING相关自身免疫疾病提供了潜在的靶向干预策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- RNF115是否以及如何调节STING介导的炎症和自身免疫？
- 核心机制
- RNF115通过催化STING和STINGN153S的K63链接多聚泛素化，促进其寡聚化和从内质网到高尔基体的转运，从而激活下游信号和炎症因子表达。
- 主要证据
- 在Trex1–/–小鼠和STINGN153S/WT小鼠模型中，敲除RNF115或使用DSF可抑制STING的K63泛素化、寡聚化、高尔基体定位及下游炎症因子表达，减轻自身免疫表型；在SLE患者PBMCs中，敲低或抑制RNF115可降低IFN和促炎因子表达。
- 研究意义
- 文章提出靶向RNF115的DSF是STING相关自身免疫疾病（如SLE）的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因敲除小鼠模型验证RNF115在自身免疫中的作用
验证RNF115是否促进Trex1–/–小鼠和STINGN153S/WT小鼠的自身免疫表型。
生成Rnf115–/–Trex1–/–小鼠和Rnf115–/–STINGN153S/WT小鼠，分析生存率、体重、器官病理、免疫细胞组成及炎症因子表达。
骨髓嵌合小鼠验证造血细胞中RNF115的作用
确定RNF115在造血细胞中是否调节STINGN153S驱动的自身免疫。
将野生型、NS或115NS小鼠的骨髓细胞移植到致死性照射的野生型或Rnf115–/–小鼠中，评估生存、免疫细胞发育和炎症指标。
体外细胞实验验证RNF115对STINGN153S的细胞类型特异性作用
验证RNF115是否特异性地调节髓系细胞中STINGN153S的激活。
比较野生型、NS和115NS小鼠的GM-DCs/Macs、MLFs和MPMECs中炎症因子表达，以及STINGN153S的亚细胞定位。
机制研究：泛素化和寡聚化分析
明确RNF115是否通过催化K63泛素化促进STING和STINGN153S的寡聚化和激活。
通过变性IP、免疫沉淀、SDD-AGE等方法检测STING的泛素化、寡聚化及其与TBK1的相互作用。
药理学验证：DSF对STING信号和自身免疫的影响
验证RNF115抑制剂DSF是否能抑制STING介导的炎症和自身免疫。
用DSF处理细胞和小鼠，检测STING泛素化、寡聚化、下游基因表达及自身免疫表型。
临床样本验证：SLE患者PBMCs
验证RNF115在SLE患者PBMCs中调节炎症因子表达的作用。
收集SLE患者外周血，分离PBMCs，敲低RNF115或DSF处理，检测ISG15、CXCL10、CCL5、IFN-α、IFN-γ等表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | CHAMOT Biotechnology | -- | |
| 药物处理 | 双硫仑 | TargetMol | -- |
| 鲁索替尼 | TargetMol | -- | |
| 环状GMP-AMP | InvivoGen | 1441190-66-4 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | -- | |
| 细胞分离 | Ficoll-Plaque PLUS试剂盒 | GE Healthcare | 17-1440-02 |
| 转染 | Ultra Fection 2.0转染试剂 | 4A Biotech | FXP092-010 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596026 |
| 氯仿 | -- | -- | |
| 异丙醇 | -- | -- | |
| 乙醇 | -- | -- | |
| RT-qPCR | All-in-One cDNA合成超混合液 | Aidlab Biotechnologies | -- |
| Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | |
| 免疫沉淀 | NP-40裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | APExBIO | K1015 | |
| 蛋白G琼脂糖 | -- | -- | |
| 抗FLAG磁珠 | -- | -- | |
| 蛋白质检测 | 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology/ABclonal | 13647 |
| 抗RNF115抗体 | Abcam | ab187642 | |
| 抗TBK1抗体 | Abcam | 96328-11 | |
| 抗磷酸化STING (Ser365)抗体 | Cell Signaling Technology | 72971S | |
| 抗磷酸化TBK1 (Ser172)抗体 | Abcam | ab109272 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F3165 | |
| 抗Tubulin抗体 | ABclonal | A12289 | |
| 抗K63链接泛素抗体 | Millipore | 05-1308 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8017 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG | Thermo Scientific | PA1-86717 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Thermo Scientific | SA1-9510 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD11b-PE抗体 | Biolegend | 101208 |
| 抗小鼠CD11c-PerCP抗体 | Biolegend | 117328 | |
| 抗小鼠Ly6G-APC-Cy7抗体 | Biolegend | 127624 | |
| 抗小鼠F4/80-BV421抗体 | Biolegend | 123137 | |
| 抗小鼠CD3-FITC抗体 | Biolegend | 100306 | |
| 抗小鼠CD19-APC抗体 | Biolegend | 152409 | |
| 抗小鼠GL7-PerCP抗体 | Biolegend | 144610 | |
| 抗小鼠FAS-PE抗体 | Biolegend | 152608 | |
| 抗小鼠CD3-APC抗体 | Biolegend | 100312 | |
| 抗小鼠CD4-FITC抗体 | Biolegend | 100406 | |
| 抗小鼠CD8-BV510抗体 | Biolegend | 100751 | |
| 抗小鼠NK1.1-APC抗体 | Biolegend | 156506 | |
| 抗小鼠CD69-FITC抗体 | Biolegend | 104506 | |
| 抗小鼠GzmB-PE抗体 | Biolegend | 372208 | |
| 抗小鼠CD4-BV421抗体 | Biolegend | 100427 | |
| 抗小鼠Sca-1-APC抗体 | Biolegend | 108111 | |
| 抗小鼠Lineage生物素抗体 | BD Biosciences | 559971 | |
| 链霉亲和素-APC-CY7 | BD Biosciences | 554063 | |
| 抗c-Kit-PE抗体 | Biolegend | 105807 | |
| 抗人CD3-PE抗体 | ABclonal | A22795 | |
| 抗人CD4-FITC抗体 | ABclonal | A22773 | |
| 抗人CD8-APC抗体 | ABclonal | A24799 | |
| 抗人IFN-γ-PE-CY7抗体 | BD Biosciences | 557643 | |
| 抗人IFN-α-PE抗体 | BD Biosciences | 560097 | |
| 佛波醇酯 | Sigma | P8139 | |
| 离子霉素 | Sigma | I0634 | |
| 高尔基体阻断剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| 细胞分离 | 肺解离试剂盒 | Miltenyi Biotech | -- |
| 抗CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗CD31抗体 | -- | -- | |
| I型胶原酶 | Worthington | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | PEI转染试剂 | Polysciences, Inc. | 24765-1 |
| 病毒实验 | 单纯疱疹病毒1型 | -- | -- |
| 动物实验 | 玉米油 | -- | -- |
| DNA提取 | 血清/血浆循环DNA提取试剂盒 | Tiangen | DP336 |
| DNA定量 | Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | ABclonal | RK30140 |
| ELISA | ABplex定制多因子ELISA试剂盒 | ABclonal Technology | -- |
| 蛋白质泛素化 | 串联泛素结合实体 | LifeSensors | -- |
| 显微镜 | 奥林巴斯FV1000荧光显微镜 | Olympus | -- |
| Aperio VERSA 8扫描仪 | Leica | -- | |
| 电泳 | 琼脂糖凝胶 | Bio-Rad | -- |
| 流式细胞术 | FACS Celesta流式细胞仪 | BD | -- |
| Fortessa流式细胞仪 | BD | -- | |
| 质谱分析 | EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 数据分析 | Proteome Discoverer软件 | Thermo Scientific | 2.4 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系和基因型：Rnf115–/–、Trex1+/–、STINGN153S/WT、Rnf115–/–Trex1–/–、Rnf115–/–STINGN153S/WT；年龄匹配；SPF环境。 阅读提示：Methods: Mice |
| 骨髓嵌合小鼠 | 受体小鼠：野生型或Rnf115–/–，10周龄，致死性照射（9 Gy，分两次4.5 Gy）；供体骨髓细胞：1×10^6，尾静脉注射。 阅读提示：Methods: Bone marrow chimeric mice |
| 细胞培养 | GM-DCs/Macs分化：骨髓细胞+GM-CSF (20 ng/ml)；MLFs：原代肺成纤维细胞；MPMECs：CD31+肺微血管内皮细胞；培养基：DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素。 阅读提示：Methods: Cell culture; Isolation of MPMECs |
| 药物处理 | DSF剂量：体外5 μM；体内：HSV-1模型20 mg/kg，自身免疫模型50 mg/kg（腹腔注射，隔日一次）；Ruxolitinib处理浓度未明确说明。 阅读提示：Methods: DSF administration; Reagents |
| cGAMP转染 | cGAMP浓度1 μg/μl，用PBS稀释（体积为培养基的50%），处理30分钟，然后换液培养3小时。 阅读提示：Methods: Transfection of cGAMP |
| 临床样本 | SLE患者诊断标准（EULAR/ACR 2019）；PBMCs分离：Ficoll-Paque PLUS；dsDNA定量：血浆dsDNA浓度，cutoff为0.1 μg/ml；siRNA或DSF处理24小时。 阅读提示：Methods: Clinical samples; Generation and treatment of PBMCs |