全外显子组测序与突变鉴定
鉴定VKH患者中的新生突变。
对25个VKH trio家庭进行全外显子组测序，并利用Sanger测序验证，发现15个新生突变，其中MPP2 p.K315N是最重要的之一。
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基于三人家系全外显子组测序发现MPP2基因新生错义突变增加Vogt-Koyanagi-Harada病风险
A de novo missense mutation in MPP2 confers an increased risk of Vogt-Koyanagi-Harada disease as shown by trio-based whole-exome sequencing
实验完整度
高研究包含全外显子组测序、目标区域测序、细胞系功能实验（CRISPR敲除、过表达、屏障功能检测）、动物模型（EAU、AAV注射、敲入小鼠）及机制验证（蛋白质组学、LC-MS/MS、Co-IP、敲低实验），具有多个独立证据层级。
主要模型
ARPE19细胞系（人视网膜色素上皮细胞） 实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠模型（C57BL/6J小鼠） MPP2-N315敲入小鼠（C57BL/6J背景）
重点核对
MPP2 p.K315N (c.G945T) 突变通过Sanger测序验证 MPP2-N315 AAV处理小鼠在EAU诱导后第14天临床评分和病理评分显著升高 MPP2-N315敲入小鼠（纯合或杂合）在EAU诱导后第14天炎症表型加重 MPP2 KO ARPE19细胞过表达MPP2-N315后IL-1β、VEGFA、IL-17E分泌增加，TEER降低 MPP2-N315与ANXA2结合能力增强，ANXA2敲低可减轻EAU炎症
摘要
Vogt–Koyanagi–Harada（VKH）病是青中年人群失明的主要原因。然而，VKH病的病因仍不清楚。在此，我们进行了首项基于三人家系的全外显子组测序研究，纳入了25例VKH患者和50例对照，随后对来自中国汉族人群的2081例VKH患者进行了研究，以发现有害突变。在VKH患者中共鉴定出15个新生突变，其中最重要的之一是膜棕榈酰化蛋白2（MPP2）p.K315N（MPP2-N315）突变。根据生物信息学预测，MPP2-N315突变具有高度有害性。此外，该突变似乎罕见，在1000基因组计划和基因组聚合数据库中不存在，并且在包括人类和小鼠在内的10个物种中高度保守。后续研究表明，在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠中，MPP2-N315突变敲入或MPP2-N315腺相关病毒处理的小鼠的病理表型和视网膜血管渗漏加重。在体外，我们使用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR–Cas9）基因编辑技术敲除内源性MPP2，然后过表达野生型MPP2或MPP2-N315。在MPP2-N315突变ARPE19细胞中，细胞因子如IL-1β、IL-17E和血管内皮生长因子A的水平升高，屏障功能被破坏。机制上，如LC–MS/MS和Co-IP所示，MPP2-N315突变比MPP2-K315具有更强的直接结合ANXA2的能力，并导致ERK3/IL-17E通路激活。总的来说，我们的结果表明MPP2-K315N突变可能增加VKH病的易感性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找VKH病的新生突变并评估其对疾病风险的影响及潜在机制。
- 核心机制
- MPP2-N315突变增强与ANXA2的直接结合，进而激活ERK3/IL-17E通路，加剧炎症反应和破坏血-视网膜屏障。
- 主要证据
- 体外ARPE19细胞实验显示突变增加细胞因子分泌和破坏屏障功能；体内EAU模型和敲入小鼠中突变加重炎症和血管渗漏；LC-MS/MS和Co-IP证实突变与ANXA2结合增强，ANXA2敲低降低ERK3和IL-17E水平。
- 研究意义
- 首次在VKH病中发现MPP2-K315N突变可能增加遗传易感性，并为葡萄膜炎治疗提供了新的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MPP2突变频率与保守性分析
评估MPP2-K315N突变在人群中的频率和保守性。
对2081例VKH患者进行靶向区域测序，并分析突变在公共数据库中的频率和跨物种保守性。
体内EAU模型评估MPP2-N315突变致病性
验证MPP2-N315突变在体内对EAU炎症的影响。
通过亚视网膜注射MPP2-N315 AAV或使用MPP2-N315敲入小鼠，诱导EAU，评估临床评分、病理评分、血管渗漏和BRB破坏。
体外ARPE19细胞功能实验
研究MPP2-N315突变对RPE细胞功能的影响。
用CRISPR-Cas9敲除ARPE19细胞中内源性MPP2，过表达野生型或突变型MPP2，检测细胞增殖、细胞因子分泌和屏障功能。
机制研究：MPP2-N315结合ANXA2并激活ERK3/IL-17E通路
阐明MPP2-N315突变加重炎症的分子机制。
用LC-MS/MS鉴定MPP2结合蛋白，Co-IP验证与ANXA2结合，Western blot检测ERK3表达，ELISA检测IL-17E分泌，并进行ANXA2敲低实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | QIAamp DNA Mini血液试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 全外显子组测序 | 安捷伦SureSelect人全外显子V6 | Agilent | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Sanger测序 | Applied Biosystems 3730XL DNA分析仪 | Thermo | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RT-qPCR | qPCR RT预混液试剂盒 | MCE | -- |
| SYBR Green qPCR预混液 | MCE | -- | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| EAU诱导 | hIRBP651-670肽段 | -- | -- |
| 完全弗氏佐剂 | -- | -- | |
| 百日咳毒素 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | V900090 | |
| 33号钝针 | Hamilton | -- | |
| Evans blue assay | 伊文思蓝 | Dalian Meilum Biotechnology Co. | MB4680 |
| 细胞培养 | ARPE19细胞系 | ATCC | -- |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | Cas9蛋白 | Aldeveron | -- |
| sgRNA | Synthego | -- | |
| Lonza 4D核转染试剂盒 | Lonza | V4XP-3032 | |
| 基因组提取试剂盒 | Tiangen | DP304 | |
| TransStart Fast Pfu DNA聚合酶 | TransGene Biotech | -- | |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | -- | -- |
| CCK-8 assay | 细胞计数试剂盒-8 | TargetMol | C0005 |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | -- | -- |
| IL-10 ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| IL-17E ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| VEGFA ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Mengbio试剂盒 | Mengbio | -- | |
| ZO-1抗体 | Abcam | ab221547 | |
| 免疫荧光 | Cy3标记二抗 | Beyotime | -- |
| 曲拉通X-100 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 透射电子显微镜 | Epon 812树脂 | Head | -- |
| EM UC7超薄切片机 | Leica | -- | |
| FEI Tecnai透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学 | TMT 10plex同位素标记试剂 | Thermo Fisher Scientific | 90110 |
| Pierce高pH反相肽段分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 84868 | |
| EASY-nLC 1000液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive HF-X四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Proteome Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MASCOT搜索引擎 | Matrix Science | -- | |
| Blast2GO软件 | BioBam | -- | |
| LC-MS/MS | MG132 | -- | -- |
| 蛋白G琼脂糖 | Roche | 11719416001 | |
| Co-IP | MPP2抗体 | -- | -- |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Abcam | ab206996 | |
| 统计分析 | SPSS软件20.0 | IBM | -- |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 全外显子组测序 | 样本量：25个VKH trio家庭；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；捕获试剂：Agilent SureSelect Human All Exon V6；分析流程：GATK3.4最佳实践 阅读提示：Methods: Whole-exome sequencing |
| EAU模型评估 | 小鼠品系和性别：6-8周龄雌性C57BL/6J；免疫方案：350μg hIRBP651-670、CFA（含500μg结核分枝杆菌H37R）、1μg百日咳毒素；评估时间：第14天；评估指标：临床评分、病理评分、血管渗漏 阅读提示：Methods: EAU induction and assessment; Results: Fig. 2 |
| AAV亚视网膜注射 | 病毒量：0.5μl；注射途径：亚视网膜；病毒类型：MPP2-K315或MPP2-N315 AAV 阅读提示：Methods: Subretinal injection of virus |
| 敲入小鼠模型 | 突变：MPP2-N315 (c.G873T)；对照：MPP2-K315；小鼠背景：C57BL/6J；诱导方案：同EAU诱导；评估时间：第14天 阅读提示：Results: 图2G-L; Methods: EAU induction |
| CRISPR-Cas9敲除ARPE19细胞 | 细胞系：ARPE19 (ATCC)；敲除方法：Cas9蛋白+sgRNA (100pmol Cas9, 300pmol sgRNA)核转染；sgRNA序列：SgRNA1和SgRNA2；敲除效率：通过Sanger测序和ICE分析验证（>99%移码突变） 阅读提示：Methods: CRISPR/Cas9 gene editing technology; Results: 图3A-B |
| 过表达与功能实验 | 慢病毒转导构建稳定株；过表达WT或N315；检测细胞增殖（CCK-8）、细胞因子分泌（ELISA）、屏障功能（TEER和酚红） 阅读提示：Methods: Lentiviral cell transduction, CCK-8 assay, ELISA, TEER assay, Phenol red infiltration assay; Results: 图3 |
| 机制研究 | LC-MS/MS鉴定结合蛋白；Co-IP验证与ANXA2结合；Western blot检测ERK3；ELISA检测IL-17E；ANXA2敲低慢病毒（siANXA2-3）敲低效率>70% 阅读提示：Methods: LC-MS/MS, Co-IP, Western blotting, ELISA; Results: 图5和6 |