建立单核细胞炎症小体活化模型
验证热灭活革兰氏阴性菌能否单步激活人单核细胞中的NLRP3炎症小体。
使用THP-1单核细胞和人原代PBMCs，用热灭活E. coli XL10、EPEC和S. typhimurium刺激，检测IL-1β释放、caspase-1切割和细胞死亡率，并用NLRP3抑制剂MCC950验证依赖性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
cFLIPs调节人单核细胞中替代性NLRP3炎症小体活化
cFLIPS regulates alternative NLRP3 inflammasome activation in human monocytes
实验完整度
高包含人单核细胞系THP-1和原代PBMCs的体外模型，使用CRISPR/Cas9基因敲除、过表达回补、抑制剂处理及免疫共沉淀等，进行了功能验证和机制验证。
主要模型
THP-1单核细胞 人原代外周血单核细胞（PBMCs）
重点核对
热灭活革兰氏阴性菌（E. coli XL10、EPEC、S. typhimurium）刺激人单核细胞，细菌与细胞比例为2:1 使用NLRP3抑制剂MCC950（10 μM）预处理0.5小时验证NLRP3依赖性 caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK（25 μM）预处理0.5小时验证caspase-8上游作用 TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol（1 μM）预处理0.5小时验证TAK1在caspase-8和cFLIP表达中的作用 CRISPR/Cas9敲除CFLAR、MAP3K7、RELA等基因，验证cFLIPs和TAK1的功能
摘要
先天免疫反应，包括炎症小体活化，对于宿主抵御病原体感染至关重要。与经典和非经典炎症小体活化不同，在本研究中，热灭活革兰氏阴性菌（HK细菌）被鉴定为人单核细胞中NLRP3炎症小体的单步刺激物，并导致细胞释放中等量的IL-1β。时间过程实验表明，这种替代性炎症反应在数小时内完成。进一步分析表明，这种内在有限的NLRP3炎症小体活化反应是由于cFLIP短异构体（cFLIPs）对caspase-8的负调控所致，该异构体由NF-κB激活。相反，过表达的cFLIPs，而非过表达的cFLIPL，抑制了人单核细胞中HK细菌感染引起的caspase-8活化和IL-1β释放。此外，我们证明了TAK1活性介导cFLIPs的表达，并且是人单核细胞中HK细菌诱导的caspase-8切割的上游和必需的。cFLIPs和TAK1的功能特异性揭示了人单核细胞对非侵入性病原体的独特反应，为NLRP3炎症小体活化的替代调控途径提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 非侵入性革兰氏阴性菌如何触发人单核细胞中的替代性NLRP3炎症小体活化，以及该过程为何导致有限的炎症反应和低细胞死亡率？
- 核心机制
- 热灭活革兰氏阴性菌通过TAK1依赖的信号通路激活caspase-8，进而活化NLRP3炎症小体；同时，NF-κB诱导cFLIPs表达，cFLIPs通过与caspase-8结合抑制其切割，从而负调控炎症小体活化，限制IL-1β释放和细胞死亡。
- 主要证据
- 在THP-1和PBMCs中，热灭活细菌诱导NLRP3依赖的caspase-1活化和IL-1β释放，但细胞死亡率低；caspase-8抑制剂和TAK1抑制剂阻断该过程；cFLIPs过表达抑制caspase-8切割和IL-1β释放，而cFLIPL无此作用；CFLAR敲除增强炎症小体活化。
- 研究意义
- 揭示了人单核细胞对非侵入性病原体的独特反应机制，为理解替代性NLRP3炎症小体活化途径的负调控提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证caspase-8在通路中的作用
确定caspase-8是否参与热灭活细菌诱导的NLRP3炎症小体活化。
使用caspase-8特异性抑制剂Z-IETD-FMK预处理细胞，检测caspase-8切割、caspase-1活化和IL-1β释放；利用TRIF敲除细胞验证TRIF依赖性。
评估炎症小体活化的时程与局限性
探究热灭活细菌诱导的炎症小体活化是否在时间上有限，以及蛋白合成抑制的影响。
在不同时间点（0-6小时）检测caspase-1、GSDMD切割和IL-1β释放；用蛋白合成抑制剂CHX预处理，观察对caspase-8切割和细胞死亡的影响。
鉴定cFLIP表达及其负调控功能
验证NF-κB诱导的cFLIPs是否负调控替代性NLRP3炎症小体活化。
检测热灭活细菌刺激后cFLIP mRNA和蛋白水平的变化；用过表达cFLIPs或cFLIPL的THP-1细胞及CFLAR敲除细胞，检测caspase-8切割、caspase-1活化和IL-1β释放。
验证TAK1的上游调控作用
确定TAK1是否在caspase-8活化和cFLIP表达中起上游调控作用。
使用TAK1抑制剂5Z-7-oxozeaenol或敲除MAP3K7，检测caspase-8切割、caspase-1活化和cFLIP表达；用caspase-8抑制剂检测对TAK1磷酸化的影响，以确定上下游关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清（FBS） | AusGeneX | FBSSA500-S | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| PBMC分离 | Ficoll-Paque PLUS密度梯度分离液 | Cytiva | 10302181 |
| SepMate-50离心管 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30243.02 |
| 抑制剂处理 | MCC950 | Sigma-Aldrich | PZ0280 |
| 5Z-7-oxozeaenol | Sigma-Aldrich | O9890 | |
| 尼日利亚霉素 | Invitrogen | tlrl-nig | |
| 活/死染色 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 |
| Hoechst 33342染料 | TargetMOI | T5840 | |
| 抑制剂处理 | Z-IETD-FMK | MCE | HY-101297 |
| 凋亡诱导 | Raptinal | AdipoGen | 1176-09-6 |
| LPS刺激 | 脂多糖（大肠杆菌O111:B4） | Beyotime | S1732 |
| AIM2炎症小体诱导 | poly(dA:dT) | InvivoGen | tlrl-patrh |
| 坏死性凋亡诱导 | BV6 | MCE | HY-16701 |
| Z-VAD-FMK | MCE | HY-16658B | |
| 重组人TNF-α | PeproTech | 300-01A | |
| NF-κB抑制 | TPCA1 | MCE | HY-10074 |
| BAY 11-7082 | MCE | HY-13453 | |
| ELISA检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY201 |
| Western blot抗体 | 抗caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3866 |
| 抗IL-1β抗体 | R&D Systems | AF-201-NA | |
| 抗NLRP3抗体 | Adipogen | AG-20B-0014-C100 | |
| 抗TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4505 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 10021787 | |
| 抗磷酸化TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4508s | |
| 抗GSDMD抗体 | ABclonal | A18281 | |
| 抗caspase-8抗体 | Cell Signaling Technology | 9746s | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118 | |
| 抗cFLIP抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5276 | |
| 抗活化的caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661s | |
| 抗His标签抗体 | ABclonal | AE003 | |
| 抗DDDDK标签抗体 | ABclonal | AE092 | |
| 抗TRIF抗体 | Cell Signaling Technology | 4596s | |
| 抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242s | |
| CRISPR/Cas9敲除 | LentiCRISPR v2载体 | Addgene | #52961 |
| 慢病毒包装 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| 逆转录 | GoScript逆转录试剂盒 | Promega | -- |
| 实时PCR | SYBR Green实时PCR预混液 | TOYOBO | -- |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫沉淀 | 抗DDDDK标签抗体偶联的Protein G琼脂糖珠 | Cell Signaling Technology | 37478S |
| 载体构建 | EasyGeno单片段组装克隆试剂盒 | TIANGEN | VI202 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞刺激 | 热灭活细菌的制备（75℃ 30分钟）及保存条件；细菌与细胞的比例（2:1）；刺激时间（THP-1 6小时，PBMC 16小时）；细胞培养条件（THP-1用无血清RPMI-1640，PBMC用1% FBS RPMI-1640）。 阅读提示：Methods: 'Bacterial culture and heat inactivation', 'Inflammasome stimulation' |
| 抑制剂处理 | 各抑制剂的浓度和预处理时间：MCC950（10 μM，0.5小时）、Z-IETD-FMK（25 μM，0.5小时）、5Z-7-oxozeaenol（1 μM，0.5小时）、CHX（1 μg/ml，0.5小时）、TPCA1（1 μM）、BAY 11-7082（2 μM）、KCl（30 mM，10分钟） 阅读提示：Methods: 'Reagents and antibodies', 'Inflammasome stimulation' |
| 基因敲除与过表达 | sgRNA序列（靶向NLRP3、MAP3K7、CFLAR、RELA、TICAM1）；慢病毒包装比例（LentiCRISPR v2:psPAX2:VSV-G = 4:3:2）；嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/ml，72小时）；cFLIPs过表达载体（fugw-2xflag-cFLIP）及包装比例（5:4:1）；回补实验中cFLIPS的突变序列及G418筛选浓度（400 μg/ml） 阅读提示：Methods: 'CRISPR/Cas9-mediated gene targeting', 'cFLIP overexpression in THP-1 cells' |
| IL-1β检测 | ELISA试剂盒（R&D Systems，DY201）；样本类型（细胞培养上清）；吸光度读取波长（450 nm和570 nm）；标准曲线绘制 阅读提示：Methods: 'Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)' |
| 细胞死亡检测 | PI浓度（5 μg/ml）和Hoechst 33342浓度（500 ng/ml）；染色和成像方法（Olympus FV-1200显微镜）；定量方法（ImageJ） 阅读提示：Methods: 'Live/dead staining assay' |