CD146在巨噬细胞中的表达分析
验证CD146在肿瘤微环境中巨噬细胞亚群的表达情况。
通过免疫组化、流式细胞术分析小鼠和人肝癌组织中CD146在巨噬细胞上的表达，结果表明CD146表达于一部分CD68+巨噬细胞，且位于肿瘤边缘。
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CD146+巨噬细胞亚群通过激活NLRP3炎症小体增强抗肿瘤免疫
A subpopulation of CD146+ macrophages enhances antitumor immunity by activating the NLRP3 inflammasome
实验完整度
高包含体外巨噬细胞功能实验、条件性基因敲除小鼠肿瘤模型、人肝癌组织分析、蛋白质组学及机制验证等两个以上独立证据层级，并有明确功能与机制验证。
主要模型
小鼠BMDMs RAW264.7巨噬细胞系 Hepa1-6小鼠肝癌细胞系 MC38小鼠结肠癌细胞系 巨噬细胞条件性CD146敲除小鼠及其对照
重点核对
CD146在巨噬细胞中的表达受STAT3信号调控，使用STAT3抑制剂可上调CD146表达 巨噬细胞CD146缺失通过激活JNK信号促进MDSC募集相关趋化因子表达 CD146通过促进NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟发挥抗肿瘤作用 TMEM176B抑制剂BayK8644可增强CD146+巨噬细胞的抗肿瘤活性 联合抗CD146抗体AA98和TMEM176B抑制剂显著抑制MC38肿瘤生长
摘要
作为肿瘤浸润性免疫细胞的主要类型之一，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）决定免疫治疗的疗效。然而，关于其表型和功能异质性的有限认知限制了其在肿瘤免疫治疗中的应用。在本研究中，我们在人类样本和动物模型中鉴定了一个发挥抗肿瘤活性的CD146+ TAMs亚群。TAMs中CD146的表达受STAT3信号负调控。减少这群TAMs通过激活JNK信号促进髓源性抑制细胞募集，从而促进肿瘤发展。有趣的是，CD146参与了肿瘤微环境中NLRP3炎症小体介导的巨噬细胞活化，部分通过抑制跨膜蛋白176B（TMEM176B），一种免疫调节阳离子通道。TMEM176B抑制剂处理增强了CD146+ TAMs的抗肿瘤活性。这些数据揭示了CD146+ TAMs的关键抗肿瘤作用，并强调了抑制CD146和TMEM176B的有前景的免疫治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD146+巨噬细胞亚群是否具有抗肿瘤功能及其作用机制是什么？
- 核心机制
- CD146负调控JNK信号通路，抑制TMEM176B表达，从而促进NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟，发挥抗肿瘤作用；CD146缺失导致JNK激活，上调趋化因子和TMEM176B，抑制炎症小体，促进MDSC募集，加速肿瘤生长。
- 主要证据
- 巨噬细胞CD146条件敲除小鼠（M-KO）中肿瘤生长加速，伴随CD8+ T细胞减少、MDSC增多；CD146过表达巨噬细胞抑制肿瘤生长；体外实验表明CD146缺失降低Caspase-1活化和IL-1β成熟，TMEM176B抑制剂可逆转此效应；蛋白质组学和转录组学分析证实相关机制。
- 研究意义
- 本研究揭示CD146是一个关键的TAMs抗肿瘤标志物，为基于TAMs的肿瘤免疫治疗策略提供新见解，并提示联合抑制CD146和TMEM176B可能具有增强抗肿瘤免疫的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CD146表达调控机制分析
探讨肿瘤微环境调节CD146表达的机制。
利用肿瘤条件培养基（TCM）刺激骨髓来源巨噬细胞（BMDM），观察CD146表达的变化，并通过蛋白质组学和转录因子富集分析筛选调控因子，检测STAT3信号通路激活及STAT3抑制剂对CD146表达的影响。
体内外功能验证
验证CD146+巨噬细胞对肿瘤生长的作用。
利用巨噬细胞CD146条件敲除小鼠（M-KO）和对照小鼠，建立皮下移植瘤、DEN诱导肝癌、原位移植瘤模型，观察肿瘤生长情况；同时将CD146过表达的Raw264.7细胞与肿瘤细胞混合注射，验证其抗肿瘤作用。
机制研究
探究CD146缺失促进肿瘤生长的分子机制。
通过体外吞噬、增殖实验排除直接作用；通过MDSC迁移实验验证趋化因子的作用；通过蛋白质组学、Western blot分析信号通路变化，并检测JNK、TMEM176B及炎症小体活化相关蛋白。
联合治疗策略评估
评估抗CD146抗体AA98与TMEM176B抑制剂联合的抗肿瘤效果。
在MC38荷瘤小鼠中，单独或联合使用AA98和BayK8644，观察肿瘤生长和免疫细胞浸润情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 免疫染色 | 抗CD146抗体 | Abcam | ab75769 |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 免疫印迹 | 抗精氨酸酶抗体 | Abcam | ab124917 |
| 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab254360 | |
| 抗NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| 抗Caspase-1抗体 | Abcam | ab179515 | |
| 抗Caspase-1抗体 | ABclonal | A0964 | |
| 抗TMEM176B抗体 | ABclonal | A16118 | |
| 抗IL-1β抗体 | ABclonal | A11369 | |
| 信号通路检测 | p44/42 MAPK抗体 | CST | 4370S |
| p38 MAPK抗体 | CST | 4511S | |
| NF-κB p65抗体 | CST | 3033S | |
| SAPK/JNK抗体 | CST | 4668S | |
| STAT3抗体 | CST | 9138S | |
| 流式细胞术 | Brilliant Violet 570抗人CD3 | BioLegend | 300435 |
| PE抗人CD146 | BioLegend | 302004 | |
| 药物处理 | BayK8644 | AbMole | M5073 |
| STAT3抑制剂 | AbMole | M3032 | |
| JNK抑制剂 | Selleck Chemicals | S7508 | |
| Bindarit | MedChemExpress | AF2838 | |
| Maraviroc | MedChemExpress | UK-427857 | |
| ELISA | CCL2 ELISA试剂盒 | LunChangShuoBiotech | ED-20568-96T |
| CCL3 ELISA试剂盒 | LunChangShuoBiotech | ED-20427-96T | |
| CCL4 ELISA试剂盒 | LunChangShuoBiotech | ED-21503-96T | |
| CXCL2 ELISA试剂盒 | LunChangShuoBiotech | ED-21268-96T | |
| CXCL5 ELISA试剂盒 | LunChangShuoBiotech | ED-27806-96T | |
| 药物处理 | 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146-25MG |
| 大鼠IgG2a对照 | Bio X Cell | BE0089 | |
| 细胞培养 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| 蛋白质组学 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| Easy-nLC系统 | Thermo Fisher | -- | |
| Proteome Discoverer软件v2.2 | Thermo Fisher | -- | |
| SEQUEST HT搜索引擎 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞功能检测 | 荧光素钾盐 | Promega | E1605 |
| 细胞分离 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi | -- |
| gentleMACS C管 | Miltenyi | -- | |
| gentleMACS解离器 | Miltenyi | -- | |
| MACS智能过滤器（70 μm） | Miltenyi | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | 文中未明确说明 | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| Amicon 0.5-mL超滤管 | EMD Millipore | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce | -- | |
| 细胞因子检测 | 细胞因子与趋化因子36-Plex小鼠ProcartaPlex Panel 1A | Luminex | -- |
| 细胞功能检测 | CFSE | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞培养 | L929条件培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| I型胶原酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| DNA酶 | 文中未明确说明 | -- | |
| 红细胞裂解液 | eBioscience | 00-4333-57 | |
| Accutase酶 | eBioscience | 00-4555-56 | |
| FcR阻断试剂，小鼠 | Miltenyi | 130-092-575 | |
| 流式细胞术 | FACS缓冲液 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BMDM诱导分化条件：L929条件培养基浓度及培养天数；TCM制备条件：肿瘤细胞种类、培养时间及稀释比例 阅读提示：Materials and methods 中的 'BMDM cell culture' 和 'Tumor cell-conditioned medium (TCM) preparation and BMDM stimulation' |
| 肿瘤模型 | 皮下移植瘤：Hepa1-6细胞数量1×10^6，MC38和EL4细胞数量2×10^5；DEN诱导模型：DEN剂量1mg/kg，CCl4剂量0.2ml/kg；原位移植瘤实验细节 阅读提示：Materials and methods 中的 'Tumor models' |
| 体外功能验证 | 吞噬实验：靶细胞CFSE标记，共培养时间2h；MDSC迁移实验：SEND-1细胞、MDSC数量、共培养时间12h；趋化因子检测：刺激时间 阅读提示：Materials and methods 中的 'Assay of BMDM phagocytosis of tumor cells' 和 'MDSC transmigration assay' |
| 信号通路验证 | JNK抑制剂浓度（25mM）及处理时间；STAT3抑制剂使用浓度和时间；TMEM176B抑制剂BayK8644使用浓度（1mg/kg） 阅读提示：Figure legends 7C、3P、9F等，Materials and methods 中的 'Antibodies and reagents' |
| 动物治疗 | AA98剂量10mg/kg，BayK8644剂量1mg/kg，STAT3抑制剂剂量10mg/kg，抗PD-1剂量10mg/kg，给药频率2次/周 阅读提示：Materials and methods 中的 'Tumor models' |
| 统计分析 | 统计方法：t检验、单因素或双因素方差分析，重复数等 阅读提示：Materials and methods 中的 'Statistical analysis' |