分析Lysm在单核细胞和组织固有巨噬细胞中的表达
确定Lysm是否可作为区分骨髓来源单核细胞和组织固有巨噬细胞的标志物。
利用Lysm-GFP报告小鼠，通过流式细胞术检测胎肝、骨髓、外周血中单核细胞，以及肺、肝、肾、脾中巨噬细胞亚群的Lysm-GFP表达，并用RNA-seq验证。
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基于溶菌酶表达定义成年小鼠中新形成和组织固有的骨髓来源巨噬细胞
Defining newly formed and tissue-resident bone marrow-derived macrophages in adult mice based on lysozyme expression
实验完整度
高包含体外诱导分化、骨髓嵌合小鼠、单核细胞过继转移、RNA-seq、组织固有巨噬细胞功能检测及基因缺陷小鼠等多层级验证。
主要模型
Lysm-GFP报告小鼠 CD45.1+小鼠 骨髓嵌合小鼠模型 骨髓来源巨噬细胞(BMDM)
重点核对
供体受体CD45.1和CD45.2的区分 单核细胞过继转移后2、4、10周的时间点分析 GM-CSF(25 ng/mL)和M-CSF(50 ng/mL)诱导BMDM的分化方案 Lysm-Cre介导的ST2、mTOR、FABP5条件敲除小鼠
摘要
组织固有巨噬细胞来源于不同的前体细胞，并表现出不同的表型。在成体中，炎症或损伤组织的组织固有巨噬细胞的重建可以通过骨髓来源的单核细胞/巨噬细胞实现。利用溶菌酶(Lysm)-GFP报告小鼠，我们发现肺泡巨噬细胞(AMs)、Kupffer细胞、红髓巨噬细胞(RpMacs)和肾脏固有巨噬细胞为Lysm-GFP−，而胎肝、成年骨髓和血液中的所有单核细胞均为Lysm-GFP+。供体来源的Lysm-GFP+固有巨噬细胞在受体内逐渐变为Lysm-GFP−，并发展出组织固有巨噬细胞特征性的基因表达谱。因此，Lysm可用于区分在病理条件下成年小鼠骨髓前体细胞来源的新形成和长期存活的组织固有巨噬细胞。此外，我们发现Irf4可能对所有组织中的固有巨噬细胞分化至关重要，而细胞因子和受体通路、mTOR信号通路和脂肪酸代谢过程分别主要调节RpMacs、Kupffer细胞和肾脏巨噬细胞的分化。ST2、雷帕霉素机制靶点(mTOR)和脂肪酸结合蛋白5(FABP5)的缺陷分别损害了肺、肝和肾中骨髓来源单核细胞/巨噬细胞向组织固有巨噬细胞的分化。这些结果表明，共同和独特的信号通路的组合协调地塑造了不同组织中组织固有巨噬细胞的分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何区分成年小鼠中骨髓来源的新形成和长期存活的组织固有巨噬细胞？
- 核心机制
- 骨髓来源单核细胞分化过程中Lysm表达逐渐下调；Irf4可能普遍调控固有巨噬细胞分化，而ST2、mTOR和FABP5分别调控脾脏、肝脏和肾脏的固有巨噬细胞分化。
- 主要证据
- Lysm-GFP报告小鼠、骨髓嵌合和单核细胞过继转移模型结合流式、RNA-seq及功能实验，证明Lysm-GFP−巨噬细胞获得组织固有巨噬细胞特征。
- 研究意义
- Lysm可作为区分新形成和长期存活组织固有巨噬细胞的标志，有助于研究组织固有巨噬细胞分化机制并可能为巨噬细胞相关疾病提供治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨髓嵌合实验检测供体来源组织固有巨噬细胞的Lysm表达
验证骨髓来源细胞分化成的组织固有巨噬细胞是否丢失Lysm表达。
将CD45.2+Lysm-GFP转基因小鼠的骨髓细胞经尾静脉注入6 Gy照射的CD45.1+受体小鼠，4周后分析供体来源的各组织巨噬细胞Lysm-GFP表达。
单核细胞过继转移追踪Lysm表达动态变化
追踪骨髓单核细胞向组织固有巨噬细胞分化过程中Lysm-GFP表达的动态变化。
分选CD45.2+CD11b+Ly6ChiLysm-GFP+骨髓单核细胞，过继转移至CD45.1+受体，分别于2、4、10周分析供体来源巨噬细胞Lysm-GFP表达。
RNA-seq和生物信息学分析Lysm-GFP+与Lysm-GFP−巨噬细胞转录组差异
探索Lysm-GFP+和Lysm-GFP−巨噬细胞之间的基因表达差异及相关信号通路。
分选供体来源Lysm-GFP+和Lysm-GFP−巨噬细胞，进行RNA-seq，分析差异表达基因、KEGG通路、转录因子网络和代谢网络。
基因缺陷小鼠验证特定通路对组织固有巨噬细胞分化的影响
验证ST2、mTOR和FABP5在脾脏、肝脏和肾脏固有巨噬细胞分化中的作用。
构建Lysm-Cre介导的ST2、mTOR和FABP5条件敲除小鼠，通过流式检测各组织固有巨噬细胞比例，并过继转移缺陷单核细胞观察分化效果。
GM-CSF和M-CSF诱导的巨噬细胞组织定植能力比较
比较GM-CSF和M-CSF诱导的骨髓来源巨噬细胞在体内分化成组织固有巨噬细胞的效率。
在体外分别用GM-CSF和M-CSF诱导BMDM，然后将其过继转移至CD45.1+受体小鼠，分析供体来源的组织固有巨噬细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01B |
| 组织消化 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | GIBCO | 16000-044 |
| 流式染色 | 可固定活力染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-14 |
| 抗小鼠Tim4抗体(PE) | BioLegend | 130005 | |
| 抗小鼠Mertk抗体(PE) | BioLegend | 151505 | |
| 抗小鼠Ly6C抗体(PE) | BioLegend | 128007 | |
| 抗小鼠F4/80抗体(PE) | BioLegend | 157304 | |
| 抗小鼠F4/80抗体(PE/Cy5) | BioLegend | 123112 | |
| 抗小鼠CD11c抗体(PE/Cy5) | BioLegend | 117316 | |
| 抗小鼠Gr-1抗体(PE/Cy5) | BioLegend | 108410 | |
| 抗小鼠CD11b抗体(PE/Cy5) | BioLegend | 101210 | |
| 抗小鼠CD45.1抗体(PE/Cy7) | BioLegend | 110730 | |
| 抗小鼠F4/80抗体(APC) | BioLegend | 123116 | |
| 抗小鼠CD45.2抗体(APC) | BioLegend | 109814 | |
| 抗小鼠CD11b抗体(Brilliant Violet 510) | BioLegend | 101263 | |
| 抗小鼠CD64抗体(Brilliant Violet 711) | BioLegend | 139311 | |
| 大鼠抗小鼠CD45RA抗体(BUV395) | BD Biosciences | 740232 | |
| 流式细胞仪分析 | 流式细胞仪LSRFortessa X-20 | BD | -- |
| 细胞分选 | 流式分选仪Fusion | BD | -- |
| 细胞培养耗材 | 10厘米培养皿 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | Lysm-GFP报告小鼠、CD45.1+小鼠、Lysm-Cre介导的条件敲除小鼠来源和背景 阅读提示：Methods - Mice |
| 骨髓移植和过继转移 | 受体照射剂量（6 Gy）、供体细胞数量（骨髓细胞10^8、单核细胞5×10^5）、注射途径（尾静脉） 阅读提示：Methods - Bone marrow chimeric mouse model |
| 骨髓来源巨噬细胞诱导 | GM-CSF浓度（25 ng/mL）、M-CSF浓度（50 ng/mL）、培养时间（7天） 阅读提示：Methods - Bone marrow-derived macrophage induction and treatment |
| 流式细胞术分析 | 单细胞悬液制备方法（研磨、消化）、抗体面板（荧光标记及克隆号） 阅读提示：Methods - Cell preparation for flow cytometry and sorting, Flow cytometry |
| RNA-seq数据处理 | 差异表达基因阈值（p<0.05, fold change>1）、比对参考基因组（mm10） 阅读提示：Methods - RNA-sequencing analysis, Data processing |