组织表达谱分析
确定TRIML1和TRIML2在猪各组织及发育阶段的表达特异性。
收集猪各组织（脑、肌肉、胃等）及卵母细胞、胚胎（2细胞至囊胚）、胚胎（12、15天）和胎盘组织（21、30天），提取RNA，进行终点PCR检测TRIML1和TRIML2表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
猪早期胚胎发育和胎盘形成过程中三方基序家族样蛋白1和2的表达
Expression of tripartite motif family-like protein 1 and 2 in early conceptus development and placentation in the pig
实验完整度
高包含组织表达谱分析（PCR和原位杂交）及CRISPR/Cas9敲除后的体细胞核移植胚胎移植实验，涵盖体内妊娠维持和形态学评估。
主要模型
猪胎儿成纤维细胞（TRIML1−/−和TRIML2−/−） 猪早期胚胎（体外受精和体细胞核移植） 猪妊娠模型（胚胎移植后的代孕母猪）
重点核对
TRIML1和TRIML2的组织特异性表达模式（PCR和原位杂交） CRISPR/Cas9介导的TRIML1和TRIML2敲除效率及纯合性（DNA和mRNA水平） SCNT胚胎的体外发育能力和移植后的妊娠率 妊娠和胎盘发育的形态学和组织学评估（天数15-36）
摘要
真兽类胎盘高度复杂，进化中调控妊娠期间胚胎附着和胎盘组织发育的炎症阶段。三方基序家族样（TRIMLs）蛋白与下调炎症有关。在哺乳动物中，TRIML1和TRIML2在性腺、植入前胚胎和胎盘中优先表达。TRIML1结构域在真兽类和有袋类之间不同，而TRIML2在有袋类中缺失，表明其可能在调节胚胎附着期间的炎症阶段中发挥独特作用，这对妊娠建立和维持至足月至关重要。本研究旨在调查TRIML1和TRIML2在猪各种组织以及胚胎发育、胚胎附着和胎盘形成过程中的表达模式。TRIML2的转录本在胚胎、胚胎、胚外膜、卵巢和睾丸中检测到，但在检查的其他组织中没有。相比之下，TRIML1表达仅在睾丸中观察到。TRIML1和TRIML2的原位杂交证实了这些结果。TRIML2在免疫豁免位点的特异性表达与其作为抗炎因子提供真兽类胎盘免疫保护的作用一致。为了进一步研究TRIML2的作用，采用CRISPR/Cas9基因编辑敲除TRIML1（对照）或TRIML2。将TRIML1−/−和TRIML2−/−猪胎儿成纤维细胞用于体细胞核移植，并将所得胚胎移植到代孕母猪中。早期胚胎和胎盘发育不受胚胎TRIML2缺失的影响。尽管发现了组织特异性表达模式，但TRIML1或TRIML2并非猪妊娠建立所必需。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIML1和TRIML2在猪早期胚胎发育、胚胎附着和胎盘形成中的表达模式及其对妊娠建立和维持的必要性。
- 核心机制
- TRIML2在免疫豁免位点（如胎盘）可能作为抗炎因子调节炎症，但基因敲除未影响妊娠建立。
- 主要证据
- 通过PCR和原位杂交检测到TRIML2在胚胎和胎盘中的表达，而TRIML1仅在睾丸中；CRISPR/Cas9敲除后SCNT胚胎移植，妊娠率和胎儿发育正常。
- 研究意义
- 表明TRIML2并非猪早期妊娠所必需，但其在精子发生和雄性生育力中的潜在作用值得进一步研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞特异性定位
验证TRIML1和TRIML2在睾丸和胎盘中的细胞特异性表达。
使用RNAscope原位杂交检测TRIML1（睾丸）和TRIML2（睾丸、胚胎、胎盘）的mRNA；免疫组化检测睾丸中TRIML1蛋白。
基因敲除细胞系构建
产生TRIML1和TRIML2敲除的猪胎儿成纤维细胞系，用于后续SCNT。
设计靶向TRIML1外显子1起始密码子和TRIML2外显子2-3的gRNA，克隆至pX330-mCherry载体，电转猪胎儿成纤维细胞，经克隆筛选和测序验证敲除。
体细胞核移植与胚胎移植
验证TRIML1或TRIML2敲除对胚胎发育和妊娠建立的影响。
将TRIML1−/−或TRIML2−/−成纤维细胞作为供体进行SCNT，胚胎体外培养至桑葚胚或囊胚，移植入代孕母猪，收集不同妊娠天数的胚胎和胎盘进行形态学和组织学评估。
形态学和组织学评估
评估基因敲除对胚胎和胎盘发育的影响。
对妊娠21-22和34-36天的胎儿和胎盘进行宏观形态学观察（大小、血管化、羊水）和组织学染色（H&E）评估母胎界面。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取 | RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| PicoPure RNA提取试剂盒 | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| 无RNase DNase试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| RNA质量检测 | NanoDrop ND-1000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | BioRad | 1708891 |
| PCR | OneTaq热启动DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0481S |
| LA Taq DNA聚合酶 | Takara | -- | |
| 原位杂交 | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | ACDbio | -- |
| RNAscope DapB探针 | ACDbio | -- | |
| TSA vivid荧光染料 | ACDbio | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| VectaMount封片剂 | VectorLabs | -- | |
| 免疫组化 | Reveal Decloaker抗原修复液 | Biocare Medical | RV1000M |
| 兔抗TRIML1抗体 | Cusabio | CSB-PA822741LA01HU | |
| Vectastain Elite ABC试剂盒 | VectorLabs | -- | |
| DAB底物 | VectorLabs | -- | |
| 基因编辑 | pX330-mCherry载体 | Addgene | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| GlutaMax添加剂 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 庆大霉素 | Gibco | -- | |
| SNCT | BTX电融合仪 | Harvard Apparatus | -- |
| 菲咯啉 | -- | -- | |
| scriptaid | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 组织表达分析 | RNA提取方法、cDNA合成条件（RNA量、反转录温度和时间）、PCR循环数（TRIML1 33循环、TRIML2 32循环） 阅读提示：Materials and methods中的Total RNA isolation和cDNA synthesis and PCR analysis部分 |
| 原位杂交 | 探针序列和稀释度、组织固定和预处理条件（烤片时间、温度、靶标修复时间） 阅读提示：Materials and methods中的TRIML1 and TRIML2in situ hybridization assays部分 |
| 基因编辑 | gRNA序列、电转参数（电压、脉冲数、质粒量）、筛选克隆的PCR和测序条件 阅读提示：Materials and methods中的CRISPR/Cas9 guides design and transfection和Clonal expansion and colony screening部分 |
| 体细胞核移植 | 卵母细胞来源、成熟条件、融合参数（电压、持续时间）、激活方法（phenanthroline处理时间和浓度）、胚胎培养条件（MU4培养基，培养时间） 阅读提示：Materials and methods中的Somatic cell nuclear transfer部分 |
| 胚胎移植 | 受体母猪的品种、年龄、体重、发情同步处理、移植胚胎数量和移植位置 阅读提示：Materials and methods中的Animals和Embryo transfer部分 |
| 妊娠分析 | 收集妊娠天数、样本处理（固定、切片、染色）、形态学和组织学评估标准 阅读提示：Materials and methods中的Embryo collection和Tissue fixation and paraffin-embedding部分，以及Results中的相关描述 |