泪液外泌体在复发性单纯疱疹病毒性角膜炎中单纯疱疹病毒1型传播中的作用

Role of tear exosomes in the spread of herpes simplex virus type 1 in recurrent herpes simplex keratitis

作者信息Huiying Huang, Sihao Liu, Xia Zhao, Peiyi Zhao, Qingqing Jia, Huixiang Ma, Quankui Lin
PMID36894762
发布时间2023-10
DOI10.1038/s41433-023-02473-4

实验完整度

包含临床样本分离、外泌体表征、细胞摄取实验和病毒标志物检测,但缺乏体内模型和明确的功能验证。

主要模型

人角膜上皮细胞(HCEC) 患者泪液样本(HSK患者与健康对照)

重点核对

样本来源:HSK患者和健康对照的泪液 外泌体分离方法:超速离心(140,000g,2小时) 细胞摄取实验:10μg/mL标记外泌体与HCEC共孵育 病毒标志物检测:western blot检测ICP0和ICP4

摘要

背景:单纯疱疹病毒性角膜炎(HSK)是最常见但严重的感染性角膜炎,具有高复发性,主要由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)引起。HSV-1在HSK中的传播机制尚不完全清楚。多项文献表明,外泌体参与病毒感染过程中的细胞间通讯。然而,关于HSV-1通过外泌体途径在HSK中传播的证据很少。本研究旨在探讨复发性HSK中HSV-1传播与泪液外泌体之间的关系。方法:本研究共收集59名参与者的泪液。通过超速离心法分离泪液外泌体,通过银染和western blot进行鉴定。通过动态光散射(DLS)测定大小。通过western blot鉴定病毒生物标志物。使用标记的外泌体研究细胞的摄取。结果:泪液外泌体确实富集于泪液中。收集的外泌体具有与相关报道一致的正常直径。外泌体生物标志物存在于泪液外泌体中。标记的外泌体在短时间内被人角膜上皮细胞(HCEC)大量摄取。细胞摄取后,在受感染的细胞中通过western blot可检测到HSK生物标志物。结论:泪液外泌体可能是复发性HSK中HSV-1的潜伏位点,并可能参与HSV-1的传播。此外,本研究证实HSV-1基因确实可以通过外泌体途径在细胞间转移,为复发性HSK的临床干预、治疗以及药物发现提供新的启示。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
HSV-1在复发性单纯疱疹病毒性角膜炎中是否通过泪液外泌体途径传播?
核心机制
泪液外泌体可能是HSV-1的潜伏位点,并通过外泌体途径在细胞间转移HSV-1基因。
主要证据
在HSK患者泪液外泌体中检测到ICP0和ICP4,且标记的外泌体可被HCEC快速摄取,感染后细胞中可检测到病毒蛋白。
研究意义
揭示泪液外泌体途径可能为复发性HSK的临床干预、治疗和药物发现提供新思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

泪液外泌体的分离与鉴定

验证从泪液中分离出的沉淀物含有外泌体。

从59名参与者收集泪液,通过超速离心法分离外泌体,使用银染和western blot检测外泌体标志物(CD81、CD9、CD63、Flotillin-1),并通过DLS测量粒径。

2

HSK病毒标志物的检测

确定泪液外泌体中是否存在HSV-1的病毒蛋白。

通过western blot检测HSK患者和健康对照泪液外泌体中的ICP0和ICP4。

3

细胞摄取外泌体的观察

验证泪液外泌体是否能被人角膜上皮细胞摄取。

用Dio标记外泌体,与HCEC共孵育不同时间(5分钟至24小时),通过共聚焦显微镜观察摄取情况。

4

病毒基因的细胞间转移验证

证实外泌体能够将HSV-1基因转移至受体细胞。

将HCEC与HSK患者来源的泪液外泌体共孵育24小时后,收集细胞提取物,通过western blot检测ICP0和ICP4。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应

产品清单

实验环节名称品牌货号
超速离心机(XPN-100)Beckman Coulter--
增强型BCA蛋白定量试剂盒Beyotime Biotechnology--
4-20% SDS-PAGE凝胶GenScript--
快速银染试剂盒Sangon Biotech--
PVDF膜Absin Biotechnology--
小鼠抗CD81抗体Santa Cruz Biotechnologysc-166029
小鼠抗ICP0抗体Santa Cruz Biotechnologysc-53070
小鼠抗ICP4抗体Santa Cruz Biotechnologysc-69809
小鼠抗GAPDH抗体Santa Cruz Biotechnologysc-47724
兔抗CD9抗体Cell Signaling Technology13174S
兔抗CD63抗体Abcamab134045
小鼠抗Flotillin-1抗体BD Biosciences610820
抗小鼠IgG,HRP偶联抗体Cell Signaling Technology7076S
抗兔IgG,HRP偶联抗体Cell Signaling Technology7074S
SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物Thermo Fisher Scientific--
马尔文Zetasizer(Nano-ZS90)Malvern--
Dio----
ExoQuick-CG cGMP级外泌体分离试剂SBI System Biosciences--
共聚焦激光扫描显微镜(LSM880 with Airyscan)Zeiss--
DMEM/F12培养基----
Dil----
Hoechst 33342----

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本收集
参与者纳入标准、泪液收集方法、样本处理条件
阅读提示:Materials and methods: Sample collection
外泌体分离
超速离心参数(140,000g,2小时,4°C)
阅读提示:Materials and methods: Exosome Isolation
外泌体表征
蛋白质上样量(7μg)、抗体信息、DLS测量条件(200μg/mL)
阅读提示:Materials and methods: Silver staining and western blot; Dynamic light scattering
细胞摄取实验
HCEC细胞系、外泌体浓度(10μg/mL)、共孵育时间(5分钟至24小时)
阅读提示:Materials and methods: Exosomes labelling and cellular uptake
病毒基因转移验证
共孵育时间(24小时)、western blot检测的蛋白(ICP0、ICP4)
阅读提示:Results: Exosomes transfer HSV-1 genes between cells; Materials and methods: Silver staining and western blot