泪液外泌体的分离与鉴定
验证从泪液中分离出的沉淀物含有外泌体。
从59名参与者收集泪液,通过超速离心法分离外泌体,使用银染和western blot检测外泌体标志物(CD81、CD9、CD63、Flotillin-1),并通过DLS测量粒径。
Role of tear exosomes in the spread of herpes simplex virus type 1 in recurrent herpes simplex keratitis
包含临床样本分离、外泌体表征、细胞摄取实验和病毒标志物检测,但缺乏体内模型和明确的功能验证。
人角膜上皮细胞(HCEC) 患者泪液样本(HSK患者与健康对照)
样本来源:HSK患者和健康对照的泪液 外泌体分离方法:超速离心(140,000g,2小时) 细胞摄取实验:10μg/mL标记外泌体与HCEC共孵育 病毒标志物检测:western blot检测ICP0和ICP4
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证从泪液中分离出的沉淀物含有外泌体。
从59名参与者收集泪液,通过超速离心法分离外泌体,使用银染和western blot检测外泌体标志物(CD81、CD9、CD63、Flotillin-1),并通过DLS测量粒径。
确定泪液外泌体中是否存在HSV-1的病毒蛋白。
通过western blot检测HSK患者和健康对照泪液外泌体中的ICP0和ICP4。
验证泪液外泌体是否能被人角膜上皮细胞摄取。
用Dio标记外泌体,与HCEC共孵育不同时间(5分钟至24小时),通过共聚焦显微镜观察摄取情况。
证实外泌体能够将HSV-1基因转移至受体细胞。
将HCEC与HSK患者来源的泪液外泌体共孵育24小时后,收集细胞提取物,通过western blot检测ICP0和ICP4。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 外泌体分离 | 超速离心机(XPN-100) | Beckman Coulter | -- |
| 蛋白质定量 | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白质电泳 | 4-20% SDS-PAGE凝胶 | GenScript | -- |
| 银染 | 快速银染试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| 蛋白质转印 | PVDF膜 | Absin Biotechnology | -- |
| Western blot 抗体 | 小鼠抗CD81抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 |
| 小鼠抗ICP0抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53070 | |
| 小鼠抗ICP4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-69809 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47724 | |
| 兔抗CD9抗体 | Cell Signaling Technology | 13174S | |
| 兔抗CD63抗体 | Abcam | ab134045 | |
| 小鼠抗Flotillin-1抗体 | BD Biosciences | 610820 | |
| Western blot 二抗 | 抗小鼠IgG,HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7076S |
| 抗兔IgG,HRP偶联抗体 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| Western blot 检测 | SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 粒径测量 | 马尔文Zetasizer(Nano-ZS90) | Malvern | -- |
| 外泌体标记 | Dio | -- | -- |
| 外泌体分离 | ExoQuick-CG cGMP级外泌体分离试剂 | SBI System Biosciences | -- |
| 细胞摄取观察 | 共聚焦激光扫描显微镜(LSM880 with Airyscan) | Zeiss | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 细胞膜染色 | Dil | -- | -- |
| 细胞核染色 | Hoechst 33342 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 参与者纳入标准、泪液收集方法、样本处理条件 阅读提示:Materials and methods: Sample collection |
| 外泌体分离 | 超速离心参数(140,000g,2小时,4°C) 阅读提示:Materials and methods: Exosome Isolation |
| 外泌体表征 | 蛋白质上样量(7μg)、抗体信息、DLS测量条件(200μg/mL) 阅读提示:Materials and methods: Silver staining and western blot; Dynamic light scattering |
| 细胞摄取实验 | HCEC细胞系、外泌体浓度(10μg/mL)、共孵育时间(5分钟至24小时) 阅读提示:Materials and methods: Exosomes labelling and cellular uptake |
| 病毒基因转移验证 | 共孵育时间(24小时)、western blot检测的蛋白(ICP0、ICP4) 阅读提示:Results: Exosomes transfer HSV-1 genes between cells; Materials and methods: Silver staining and western blot |