构建条件性基因敲除小鼠模型
实现Yap1和Wwtr1在雌性生殖道中的条件性突变，以研究其在妊娠中的作用。
将PgrCre/+雄性小鼠与Yapfl/flWwtr1fl/fl雌性小鼠交配，生成不同等位基因组合的突变体，包括Yap1突变体（Y）、Wwtr1突变体（W）、Yap1和Wwtr1杂合突变体（YWH）、Yap1和Wwtr1三重等位基因突变体（YWT）。
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YAP1和WWTR1是小鼠妊娠启动所必需的
YAP1 and WWTR1 are required for murine pregnancy initiation
实验完整度
高包含体内动物模型（条件性基因敲除小鼠）、人工蜕膜化实验、生育力评估、胚胎运输分析、组织学、免疫组化、全组织免疫荧光三维成像及批量RNA测序等多种证据层级。
主要模型
小鼠模型（PgrCre/+Yapfl/+Wwtr1fl/fl三重等位基因突变，YWT） 野生型小鼠（对照）
重点核对
小鼠基因型（PgrCre/+Yapfl/+Wwtr1fl/fl） 交配后天数（dpc）时间点（1.5, 3.5, 4.5, 5.5, 7.5, 9.5, 12.5） 生育力评估（3-6个月繁殖试验） 人工蜕膜化处理（17β-雌二醇和孕酮注射方案） 统计方法（t检验、ANOVA、FDR校正）
摘要
子宫内膜基质细胞蜕膜化是妊娠成功所必需的。尽管这一过程对生育至关重要，但许多参与蜕膜化的复杂分子机制仍未明确。已被认为参与人类子宫内膜基质细胞体外蜕膜化的一个通路是Hippo信号通路。此前两项研究表明，Hippo信号通路的效应因子YAP1和WWTR1是原代子宫内膜基质细胞体外蜕膜化所必需的。为了研究YAP1和WWTR1在体内蜕膜化和妊娠启动中的作用，我们生成了由孕激素受体Cre介导的Yap1和Wwtr1等位基因组合突变。雌性Yap1和Wwtr1三重等位基因突变体表现出生育力低下、蜕膜化反应受损、子宫内膜容受性降低、胚胎发育延迟，以及在交配后7.5天出现独特的转录谱。批量mRNA测序揭示了异常的母体重塑，表现为突变母体在交配后7.5天细胞外基质编码基因的显著改变，并富集了与先兆子痫和子宫内膜异位症等生育受损疾病相关的条目。此外，差异表达基因方向性地与通过微阵列鉴定的雌激素受体和表皮生长因子受体调控基因重叠。我们的结果表明，Yap1和Wwtr1是成功的哺乳动物妊娠启动所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP1和WWTR1在体内小鼠蜕膜化和妊娠启动中的作用是什么？
- 核心机制
- YAP1和WWTR1可能作为转录共激活因子，与TEAD结合后调节雌激素和孕激素受体应答基因的增强子，从而影响子宫内膜容受性和蜕膜化。
- 主要证据
- YWT小鼠生育力低下、蜕膜化反应受损（Wnt4和Bmp2表达降低）、子宫内膜容受性降低（Ihh和Nr2f2表达降低）、胚胎发育延迟，以及7.5dpc子宫转录组中细胞外基质基因表达异常并与ERKO和EGFRKO的DEG重叠。
- 研究意义
- 研究揭示YAP1和WWTR1是哺乳动物妊娠启动所必需的，为理解Hippo信号通路在女性生殖功能中的作用提供了新见解，并可能与先兆子痫和子宫内膜异位症等疾病相关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生育力评估
评估不同基因型雌性小鼠的生育能力。
将不同基因型的雌性小鼠与已知可育的野生型雄性小鼠进行为期3或6个月的繁殖试验，记录产仔数和窝数。
胚胎运输和发育分析
检查YWT小鼠的排卵、受精和胚胎运输是否异常。
在交配后1.5dpc进行输卵管冲洗，3.5dpc进行子宫和输卵管冲洗，计数胚胎并分类；在3.5dpc和5.5dpc进行全组织免疫荧光和三维成像，分析胚胎形态和植入腔形态。
子宫内膜容受性分析
评估YWT小鼠在3.5dpc的子宫内膜容受性。
通过qPCR检测Pgr、Ihh、Nr2f2的表达，免疫组化检测PGR和Ki67表达，以及血清激素水平测定。
人工蜕膜化实验
评估YWT小鼠的蜕膜化反应能力。
对去卵巢的小鼠进行激素处理，诱导人工蜕膜化，5天后收集子宫，测量子宫湿重比，并检测Wnt4和Bmp2的表达。
转录组分析
揭示YWT小鼠妊娠早期子宫的转录变化。
对7.5dpc的子宫组织进行批量mRNA测序，分析差异表达基因，并进行基因本体和疾病富集分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 生殖道冲洗 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| cDNA合成 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| qPCR | SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| BioRad CFX Opus 384 qPCR系统 | BioRad | -- | |
| RNA纯化 | RNA清洁和浓缩试剂盒 | Zymo | -- |
| DNA酶处理 | TURBO DNA-free试剂盒 | Invitrogen | -- |
| RNA浓度测定 | Qubit RNA BR检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| RNA测序建库 | Illumina链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| RNA测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 组织成像 | Leica TCS SP8 X共聚焦激光扫描显微镜系统 | Leica Microsystems | -- |
| 图像分析 | Imaris v9.2.1 | Bitplane | -- |
| ImageJ | NIH | -- | |
| 免疫组化 | DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 抗原修复液 | Vector Laboratories | -- | |
| 全组织免疫荧光 | Hoechst染料 | Sigma Aldrich | -- |
| 组织透明 | BABB透明液 | -- | -- |
| 免疫组化 | 抗YAP抗体 | -- | 详见补充表1 |
| 抗WWTR1抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 抗ER-α抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 抗PGR抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 抗Ki67抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 抗SUSD2抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 抗ASMA抗体 | -- | 详见补充表1 | |
| 全组织免疫荧光 | 抗CDH1抗体 | Takara Biosciences | M108 |
| 抗细胞角蛋白8抗体 | Invitrogen | MA5–14476 | |
| 抗FOXA2抗体 | Abcam | ab108422 | |
| Alexa Fluor 555驴抗兔IgG | Invitrogen | A31572 | |
| 647山羊抗大鼠二抗 | Invitrogen | A21247 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 建立条件性基因敲除小鼠 | 小鼠品系和基因型（PgrCre/+雄性与Yapfl/flWwtr1fl/fl雌性杂交） 阅读提示：见Materials and Methods-Animal Models |
| 生育力评估 | 繁殖试验时长（3或6个月）、雌鼠与雄鼠合笼方式、产仔数和窝数记录 阅读提示：见Materials and Methods-Fertility Evaluation及Table 1 |
| 胚胎运输分析 | 时间点（1.5dpc和3.5dpc）、冲洗方式（输卵管和子宫冲洗）、胚胎计数和分类标准 阅读提示：见Materials and Methods-Oviductal and Uterine Flushes |
| 子宫内膜容受性分析 | qPCR检测的基因（Pgr、Ihh、Nr2f2）、免疫组化检测的蛋白（PGR、Ki67）、血清激素水平测定方法 阅读提示：见Materials and Methods-Immunohistochemistry及RNA isolation and real-time quantitative PCR |
| 人工蜕膜化 | 去卵巢时间、激素处理方案（17β-雌二醇和孕酮剂量及注射方式）、子宫刮擦方式、蜕膜化维持时间（5天）、样本量（n=5/基因型） 阅读提示：见Materials and Methods-Artificial Decidualization |
| 转录组分析 | 测序平台（NovaSeq 6000）、读长（配对末端150bp）、差异表达基因阈值（FDR<0.05）、样本量（YWT n=3，对照n=4） 阅读提示：见Materials and Methods-RNA-sequencing and data analysis |