构建颗粒细胞特异性Fgfr2条件敲除小鼠
验证颗粒细胞中FGFR2信号缺失对雌性生育力的影响
通过将Fgfr2flox小鼠与Amhr2Cre敲入小鼠杂交生成cKO小鼠，并通过PCR和免疫组化确认颗粒细胞中FGFR2表达降低。
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小鼠颗粒细胞中FGF受体2信号对于正常雌性生育力是必需的
FGF receptor 2 signaling in granulosa cells is required for normal female fertility in mice
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、生育力检测、组织学分析、体外卵丘扩展、卵母细胞成熟和胚胎移植等多个独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
主要模型
颗粒细胞特异性Fgfr2条件敲除（cKO）小鼠 卵丘-卵母细胞复合体（COC） 体外成熟卵母细胞 胚胎移植模型
重点核对
Fgfr2 cKO小鼠基因型确认（Fgfr2flox/flox; Amhr2Cre/+ vs Fgfr2flox/flox） 颗粒细胞中Fgfr2、Fgfr1、Fgfr4 mRNA表达水平 卵丘细胞中Pfkp、Ldha、Slc2a1 mRNA表达水平 体外成熟培养中是否添加丙酮酸钠（25 μg/mL） 胚胎移植后出生率
摘要
FGF信号已被认为参与哺乳动物卵泡发育，但其在体内对雌性生育力的作用仍不清楚。为研究这一作用，我们生成了缺失FGF受体2（FGFR2）的颗粒细胞特异性条件敲除（cKO）小鼠。Fgfr2 cKO雌性小鼠尽管卵泡发育、动情周期和排卵正常，但生育力显著降低。相反，cKO小鼠的卵丘细胞中糖酵解酶如PFKP和LDHA的表达降低，可能损害对卵母细胞的代谢支持。因此，cKO卵丘细胞在体外条件下支持卵母细胞减数分裂恢复的能力低于对照细胞。此外，虽然cKO卵母细胞体外发育到囊胚的速率正常，但胚胎移植后足月发育的能力显著降低。这些发现表明，颗粒细胞中FGFR2介导的FGF信号对于正常雌性生育力至关重要，可能是通过调节卵丘细胞的糖酵解和促进卵母细胞发育能力来实现的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 颗粒细胞中FGFR2介导的FGF信号是否在体内对雌性生育力至关重要？
- 核心机制
- FGFR2信号调节卵丘细胞糖酵解酶（PFKP、LDHA）的表达，为卵母细胞提供代谢支持，从而促进卵母细胞发育能力。
- 主要证据
- Fgfr2 cKO雌鼠生育力降低，卵丘细胞中Pfkp和Ldha mRNA降低，体外无丙酮酸条件下卵母细胞减数分裂恢复率降低，胚胎移植后出生率降低。
- 研究意义
- 首次证明卵泡FGF信号在体内对调节卵丘细胞糖酵解和支持雌性生育力具有重要作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生育力检测
评估Fgfr2 cKO雌性小鼠的生育力
将2月龄cKO和对照雌鼠与野生型CD-1雄鼠交配，记录6个月内每窝产仔数和每月窝数。
卵巢组织学分析
评估Fgfr2 cKO小鼠卵巢形态和卵泡发育
收集3周龄和4月龄小鼠卵巢，进行HE染色，统计各阶段卵泡数量。
动情周期检测
评估Fgfr2 cKO小鼠动情周期是否正常
通过每日阴道涂片连续3周分析动情周期各阶段分布。
卵丘扩展检测
评估Fgfr2 cKO小鼠卵丘扩展能力
通过超排卵观察体内卵丘扩展，并分离COC进行EGF刺激的体外卵丘扩展实验，评估扩展指数和相关基因表达。
卵母细胞体外成熟
评估Fgfr2 cKO卵丘细胞支持卵母细胞减数分裂的能力
分离COC，在含或不含丙酮酸钠的培养基中培养14小时，去除卵丘细胞后评估第一极体挤出率。
体外受精和胚胎移植
评估Fgfr2 cKO卵母细胞发育能力和足月发育能力
通过超排卵收集卵母细胞，进行IVF，培养至囊胚，部分2细胞胚胎冷冻后移植到假孕雌鼠，观察出生率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | Amhr2Cre敲入小鼠 | -- | -- |
| Fgfr2 floxed小鼠 | The Jackson Laboratory | Fgfr2 tm1Dor/J | |
| 激素处理 | 孕马血清促性腺激素 | ASKA Pharmaceutical Co., Ltd | -- |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Asuka Pharmaceutical | -- | |
| 培养基 | MEMα培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TYH培养基 | -- | -- | |
| KSOMAA培养基 | -- | -- | |
| 药物处理 | 米力农 | Sigma-Aldrich | -- |
| 表皮生长因子 | PeproTech | -- | |
| 细胞培养 | 青霉素G钾 | Meiji Seika Pharma | -- |
| 硫酸链霉素 | Meiji Seika Pharma | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNA提取 | ReliaPrep RNA细胞小提系统 | Promega | -- |
| 逆转录 | ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（含gDNA去除剂） | TOYOBO | -- |
| 实时PCR | THUNDERBIRD qPCR预混液 | TOYOBO | -- |
| ABI StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | 抗FGFR2 (Bek)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-122 |
| ImmPRESS-HRP检测试剂盒 | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 组织学 | Bouin固定液 | -- | -- |
| Pathoprep568石蜡 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | -- | |
| 胚胎冷冻 | CARD方法 | -- | -- |
| 统计分析 | JMP Pro 18版 | SAS Institute | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Fgfr2条件敲除小鼠构建 | Fgfr2flox/flox; Amhr2Cre/+基因型，对照组为同窝Fgfr2flox/flox；小鼠背景为C57BL/6N; CD-1混合背景 阅读提示：Materials and methods中Granulosa cell-specific Fgfr2 conditional knockout mice |
| 生育力检测 | 雌鼠年龄：2月龄；交配雄鼠：野生型CD-1；观察期：6个月；记录每窝产仔数和每月窝数 阅读提示：Materials and methods中Mating test and evaluation of the estrous cycle |
| 卵丘扩展分析 | EGF浓度：10 ng/mL；评估时间：形态学14小时，基因表达4小时 阅读提示：Materials and methods中Induction of cumulus expansion in vitro |
| 卵母细胞体外成熟 | 培养条件：MEM培养基，加或不加丙酮酸钠（25 μg/mL），EGF 10 ng/mL，培养14小时 阅读提示：Materials and methods中In vitro maturation of oocytes |
| 体外受精与胚胎移植 | 超排卵：5 IU PMSG后44-46小时5 IU hCG；IVF精子：野生型CD-1；胚胎培养至囊胚；胚胎移植数量：10-12个2细胞胚胎/受体 阅读提示：Materials and methods中In vitro fertilization (IVF) and embryo transfer |