BSG表达鉴定
确定滋养层细胞系中BSG转录本和蛋白的表达情况。
通过RT-PCR检测BSG亚型2、3、4,免疫印迹检测细胞裂解物和条件培养基中BSG蛋白。
Human placental trophoblast cells express and secrete basigin via a regulated process of extracellular vesicle release
研究使用多种滋养层细胞系,结合RT-PCR、免疫印迹、NTA、STEM等技术,验证BSG转录本和蛋白表达、EVs释放及其调控机制,但缺乏体内模型和功能验证实验。
HTR-8/SVneo人滋养层细胞系 JAR人绒毛膜癌细胞系 JEG-3人绒毛膜癌细胞系
细胞系:HTR-8/SVneo(传代10-18)、JAR(传代6-8)、JEG-3(传代5-7) PMA浓度:0、100、200 ng/ml,处理2或4小时 Bis浓度:4.5 ng/ml,处理2小时或预处理1小时 IL-1β和TGF-β1浓度:0、1、2.5、5 ng/ml,处理8或24小时 缺氧/复氧条件:2% O2 4小时+8% O2 30分钟
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定滋养层细胞系中BSG转录本和蛋白的表达情况。
通过RT-PCR检测BSG亚型2、3、4,免疫印迹检测细胞裂解物和条件培养基中BSG蛋白。
验证BSG通过EVs释放并鉴定EVs的特性。
超速离心分离EVs,使用NTA、STEM和Western blot进行表征。
研究PKC通路对BSG-EV释放的调控。
用PMA(PKC激活剂)和Bis(PKC抑制剂)处理HTR-8/SVneo细胞,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹检测BSG。
评估缺氧/复氧对BSG-EV释放的影响。
将HTR-8/SVneo细胞暴露于不同氧浓度(2%、8%、20% O2)或缺氧/复氧条件,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹和BCA检测。
研究IL-1β和TGF-β1对BSG-EV释放及BSG mRNA水平的影响。
用不同浓度的IL-1β或TGF-β1处理HTR-8/SVneo细胞,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹和qPCR检测BSG蛋白和mRNA。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Cellgro | 10-040 |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Plant cell Labs | TRL02 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen Inc. | 74104 |
| cDNA合成 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| 基因表达分析 | TaqMan通用PCR预混液 | Applied Biosystems | 4304437 |
| BSG基因表达分析试剂盒 | Applied Biosystems | HS00174305-m1 | |
| POP4基因表达分析试剂盒 | Applied Biosystems | Hs00198357-m1 | |
| PCR反应 | MicroAmp光学384孔反应板 | Applied Biosciences | 4309849 |
| RT-PCR | SuperScript III第一链合成系统 | Invitrogen | 18080-051 |
| Takara Prime STAR HS DNA聚合酶反应预混液 | Takara Bio Inc. | R010A | |
| 药物处理 | PMA | Sigma-Aldrich | P1585-IMG |
| Bis | EMD Millipore | 203291 | |
| 细胞因子处理 | 白细胞介素-1β | R&D Systems | P1585-IMG |
| 转化生长因子-β1 | R&D Systems, Inc. | 240-B | |
| 蛋白质浓缩 | Amicon Ultra-15离心过滤器(10 KDa截留) | EMD Millipore | UFC91024 |
| EVs分离 | 超速离心机 | -- | -- |
| NTA | NanoSight NS300系统 | -- | NS300 |
| TEM | 扫描透射电子显微镜 | Thermo Fisher | FEI |
| 蛋白质分析 | Precision Plus蛋白全蓝分子量标准 | Bio-Rad Laboratories | 161-0373 |
| 硝酸纤维素膜 | Thermo Scientific | 88018 | |
| PVDF膜 | EMD Millipore | IPVH00010 | |
| 抗人CD147一抗 | BD Biosciences | 555961 | |
| 抗人MCT1一抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-50324 | |
| 抗人整合素B1一抗 | Chemicon International | MAB2251Z | |
| 抗CD81一抗 | Abcam | ab155760 | |
| 抗CD9一抗 | Abcam | ab223052 | |
| 抗肌动蛋白一抗 | Abcam | ab179467 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | Cell Signaling | 7076S | |
| HRP标记的抗兔IgG | Cell Signaling | 7074S | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Pierce Chemical Co. | PI34080 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 | |
| μ Quant酶标仪 | Bio-Tek Instruments, Inc. | SKU | |
| 缺氧实验 | 缺氧控制系统 | Plas Labs, Inc. | -- |
| TEM | 200目Ted Pella TEM载网 | Ted Pella | -- |
| 醋酸铀 | -- | -- | |
| AMT BIOSPR16相机 | -- | BIOSPR16 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系、传代次数、细胞密度、培养基、血清浓度 阅读提示:Materials and Methods: Cell Culture |
| RT-PCR | RNA提取方法、引物序列、PCR条件 阅读提示:Materials and Methods: RNA Extraction and Gene Expression |
| PMA和Bis处理 | PMA浓度、处理时间、Bis浓度、处理顺序 阅读提示:Materials and Methods: Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and Bisindolylmaleimide (Bis) Treatment Studies |
| IL-1β和TGF-β1处理 | 细胞因子浓度、处理时间 阅读提示:Materials and Methods: IL-1β and TGF-β1 Treatment Studies |
| 缺氧/复氧 | 氧气浓度、处理时间、缺氧/复氧顺序 阅读提示:Materials and Methods: Hypoxia/Reoxygenation Experiment |
| EVs分离 | 超速离心转速、时间、条件培养基体积 阅读提示:Materials and Methods: Extracellular Vesicle Isolation |