人胎盘滋养层细胞通过细胞外囊泡释放的调控过程表达和分泌basigin

Human placental trophoblast cells express and secrete basigin via a regulated process of extracellular vesicle release

作者信息Muhammad Ashir Nabeel, Victoriya Ermilova, Kailiang Li, Richard Leach, Romana A Nowak
PMID40996566
发布时间2025-09
DOI10.1530/REP-25-0045

实验完整度

中

研究使用多种滋养层细胞系,结合RT-PCR、免疫印迹、NTA、STEM等技术,验证BSG转录本和蛋白表达、EVs释放及其调控机制,但缺乏体内模型和功能验证实验。

主要模型

HTR-8/SVneo人滋养层细胞系 JAR人绒毛膜癌细胞系 JEG-3人绒毛膜癌细胞系

重点核对

细胞系:HTR-8/SVneo(传代10-18)、JAR(传代6-8)、JEG-3(传代5-7) PMA浓度:0、100、200 ng/ml,处理2或4小时 Bis浓度:4.5 ng/ml,处理2小时或预处理1小时 IL-1β和TGF-β1浓度:0、1、2.5、5 ng/ml,处理8或24小时 缺氧/复氧条件:2% O2 4小时+8% O2 30分钟

摘要

成功的妊娠依赖于滋养层细胞对母体子宫内膜的调控性侵袭以及随后的螺旋动脉重塑。多种因素参与调控这些过程,包括基质金属蛋白酶(MMPs)、细胞因子如白细胞介素(IL)和转化生长因子β(TGFβ),以及低氧条件。Basigin(BSG)是一种糖基化蛋白,在MMP诱导和炎症中发挥重要作用。BSG在胎盘发育早期的作用及其由滋养层细胞分泌的过程尚不清楚。本研究探讨了滋养层细胞通过细胞外囊泡(EVs)分泌BSG的机制,以及BSG在EVs中的释放是否是一个调控过程。使用RT-PCR鉴定了滋养层样细胞系JAR、JEG-3和HTR-8/SVneo中的BSG亚型2、3和4。通过免疫印迹证实了滋养层细胞系和条件培养基中BSG蛋白的表达。我们证实了BSG通过EVs从HTR-8/SVneo细胞释放。用蛋白激酶C激活剂PMA处理HTR-8/SVneo细胞增加了含BSG的EVs的释放,而蛋白激酶C抑制剂Bis则减少了释放。缺氧/复氧增加了释放的EVs中BSG蛋白的含量。IL-1β增强了,而TGF-β1减少了释放的EVs中的BSG。这种效应发生在转录后水平,因为释放的EVs数量和HTR-8/SVneo细胞中BSG mRNA水平均未改变。我们的研究结果支持,通过EVs释放的BSG可能在胎盘发育早期促进滋养层细胞与子宫细胞之间的相互作用中发挥重要作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨basigin是否通过细胞外囊泡从滋养层细胞释放,以及该释放过程是否受到调控。
核心机制
BSG通过EVs释放,该过程受PKC通路调节,并受缺氧/复氧、IL-1β和TGF-β1影响,且效应发生在转录后水平。
主要证据
在HTR-8/SVneo细胞中,PMA增加BSG-EV释放,Bis抑制;缺氧/复氧增加BSG-EV释放;IL-1β增强,TGF-β1减少BSG-EV释放,但不改变总EV蛋白量和BSG mRNA水平。
研究意义
研究提出BSG通过EVs释放可能作为信号分子促进滋养层细胞与子宫细胞间相互作用,参与早期胎盘发育和螺旋动脉重塑。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

BSG表达鉴定

确定滋养层细胞系中BSG转录本和蛋白的表达情况。

通过RT-PCR检测BSG亚型2、3、4,免疫印迹检测细胞裂解物和条件培养基中BSG蛋白。

2

EVs分离与鉴定

验证BSG通过EVs释放并鉴定EVs的特性。

超速离心分离EVs,使用NTA、STEM和Western blot进行表征。

3

PMA和Bis处理研究

研究PKC通路对BSG-EV释放的调控。

用PMA(PKC激活剂)和Bis(PKC抑制剂)处理HTR-8/SVneo细胞,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹检测BSG。

4

缺氧/复氧实验

评估缺氧/复氧对BSG-EV释放的影响。

将HTR-8/SVneo细胞暴露于不同氧浓度(2%、8%、20% O2)或缺氧/复氧条件,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹和BCA检测。

5

细胞因子处理研究

研究IL-1β和TGF-β1对BSG-EV释放及BSG mRNA水平的影响。

用不同浓度的IL-1β或TGF-β1处理HTR-8/SVneo细胞,收集条件培养基,分离EVs,通过免疫印迹和qPCR检测BSG蛋白和mRNA。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基Cellgro10-040
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150
胰蛋白酶-EDTA溶液Plant cell LabsTRL02
RNeasy Mini试剂盒Qiagen Inc.74104
高容量cDNA逆转录试剂盒Applied Biosystems4368814
TaqMan通用PCR预混液Applied Biosystems4304437
BSG基因表达分析试剂盒Applied BiosystemsHS00174305-m1
POP4基因表达分析试剂盒Applied BiosystemsHs00198357-m1
MicroAmp光学384孔反应板Applied Biosciences4309849
SuperScript III第一链合成系统Invitrogen18080-051
Takara Prime STAR HS DNA聚合酶反应预混液Takara Bio Inc.R010A
PMASigma-AldrichP1585-IMG
BisEMD Millipore203291
白细胞介素-1βR&D SystemsP1585-IMG
转化生长因子-β1R&D Systems, Inc.240-B
Amicon Ultra-15离心过滤器(10 KDa截留)EMD MilliporeUFC91024
超速离心机----
NanoSight NS300系统--NS300
扫描透射电子显微镜Thermo FisherFEI
Precision Plus蛋白全蓝分子量标准Bio-Rad Laboratories161-0373
硝酸纤维素膜Thermo Scientific88018
PVDF膜EMD MilliporeIPVH00010
抗人CD147一抗BD Biosciences555961
抗人MCT1一抗Santa Cruz Biotechnologysc-50324
抗人整合素B1一抗Chemicon InternationalMAB2251Z
抗CD81一抗Abcamab155760
抗CD9一抗Abcamab223052
抗肌动蛋白一抗Abcamab179467
HRP标记的抗小鼠IgGCell Signaling7076S
HRP标记的抗兔IgGCell Signaling7074S
SuperSignal West Pico化学发光底物Pierce Chemical Co.PI34080
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Scientific23225
μ Quant酶标仪Bio-Tek Instruments, Inc.SKU
缺氧控制系统Plas Labs, Inc.--
200目Ted Pella TEM载网Ted Pella--
醋酸铀----
AMT BIOSPR16相机--BIOSPR16

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养
细胞系、传代次数、细胞密度、培养基、血清浓度
阅读提示:Materials and Methods: Cell Culture
RT-PCR
RNA提取方法、引物序列、PCR条件
阅读提示:Materials and Methods: RNA Extraction and Gene Expression
PMA和Bis处理
PMA浓度、处理时间、Bis浓度、处理顺序
阅读提示:Materials and Methods: Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and Bisindolylmaleimide (Bis) Treatment Studies
IL-1β和TGF-β1处理
细胞因子浓度、处理时间
阅读提示:Materials and Methods: IL-1β and TGF-β1 Treatment Studies
缺氧/复氧
氧气浓度、处理时间、缺氧/复氧顺序
阅读提示:Materials and Methods: Hypoxia/Reoxygenation Experiment
EVs分离
超速离心转速、时间、条件培养基体积
阅读提示:Materials and Methods: Extracellular Vesicle Isolation