长期冷冻保存对曼切加公羊(Ovis aries)精子质量和氧化应激的影响

Effects of long-term cryopreservation on sperm quality and oxidative stress in Manchega rams (Ovis aries)

作者信息Pedro Javier Soria-Meneses, Alejandro Jurado-Campos, Alejandro Rubio de Juan, Vidal Montoro Angulo, Ana Josefa Soler, José Julián Garde, Manuel Ramón Fernández, María Del Rocío Fernández-Santos
PMID40953820
发布时间2025-09-15
DOI10.1530/REP-24-0402

实验完整度

研究包含精子样本分析(流式细胞术、SCSA)和遗传趋势分析(系谱与基因组),但无功能验证或机制实验,属于观察性研究。

主要模型

曼切加羊冷冻精液样本(来自145只公羊,储存长达25年) 曼切加羊种质库中的系谱与基因组数据

重点核对

样本量:145只公羊,涵盖7个世代,来自曼切加羊品种种质库 精子样本冷冻保存条件:使用Biladyl®冷冻稀释液,浓度400×10^6精子/mL稀释至200×10^6精子/mL,降温曲线-20°C/min至-100°C,-10°C/min至-140°C 检测时间点:解冻后0小时和2小时(37°C孵育) 检测指标:精子活力(YO-PRO-1/PI)、凋亡样变化、ROS产生(CM-H2DCFDA)、脂质过氧化(C11-BODIPY)、染色质完整性(SCSA®,%DFI和%HDS) 统计分析:回归模型,世代固定效应(分类和二次多项式),孵育时间,公羊效应随机;遗传趋势使用BLUPF90估计

摘要

摘要 简而言之 这项研究评估了长期冷冻保存对曼切加公羊氧化应激和精子质量的影响,提示精子质量下降可能主要归因于冷冻保存时长而非遗传效应。 摘要 冷冻保存在人工授精方案和种质库建立中起着重要作用。然而,冷冻保存是导致氧化应激增加的关键因素,可能随着时间推移导致精子质量恶化。本研究检验了储存长达25年的曼切加羊精子样本中氧化应激水平是否存在差异。假设这些差异可能源于储存时间或针对生产性状的遗传选择,考虑到生产性状与繁殖性状之间的拮抗关系。分析了来自145只公羊的冷冻精子样本,这些样本均在相同年龄冷冻,并在相同条件下处理以最小化变异。评估了精子活力、细胞内活性氧产生、脂质过氧化和染色质完整性。评估了冷冻保存储存时间对精子质量的影响,并使用系谱和基因组数据估计遗传趋势,以探索与繁殖基因的潜在关联。我们的结果显示,各代际间精子质量参数变化极小。氧化应激指标呈负向趋势,而精子活力呈轻微正向趋势,这表明氧化应激可能对较老的冷冻样本影响更大。遗传趋势分析未显示显著差异,也未发现与繁殖基因的关联,这表明精子质量下降主要归因于储存时间而非遗传选择。然而,精子质量受本研究中未检测的多个基因影响,因此不能完全排除遗传效应。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
长期冷冻保存是否通过氧化应激影响曼切加公羊精子质量,这种影响是否与储存时间或遗传选择有关?
核心机制
储存时间较长的冷冻精子样本氧化应激水平较高,表现为ROS产生和脂质过氧化增加,可能导致精子活力下降和凋亡样变化增加;遗传趋势分析未发现显著变化,提示氧化应激的影响主要与储存时间相关。
主要证据
对145只公羊(7个世代)的冷冻精液样本进行分析,发现ROS产生和脂质过氧化随世代(反映储存时间)呈线性下降,精子活力呈线性上升,而遗传趋势分析未见显著变化。
研究意义
研究首次对种质库中冷冻保存超过25年的精子样本进行多世代氧化应激评估,强调了长期储存中氧化应激对精子质量的潜在影响,并建议在冷冻前后常规使用抗氧化策略以减少相关损伤。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

样本选择与冷冻保存

获取不同世代(储存时间)的曼切加公羊冷冻精液样本,以评估氧化应激的影响。

从曼切加羊种质库中选取145只公羊的冷冻精液样本,涵盖7个世代,所有样本均在相同年龄(3-3.5岁)和相同条件下采集、冷冻(Biladyl®稀释液,浓度200×10^6精子/mL,程序降温),储存于液氮中。

2

精子质量与氧化应激指标检测

测量解冻后不同时间点的精子活力、ROS产生、脂质过氧化和染色质完整性,以评估氧化应激水平。

使用流式细胞术(CytoFlex S)检测精子活力(YO-PRO-1/PI)、ROS产生(CM-H2DCFDA)和脂质过氧化(C11-BODIPY),使用SCSA®法检测染色质完整性(%DFI和%HDS),分别在解冻后0小时和2小时(37°C孵育)进行。

3

遗传趋势分析

评估精子质量参数是否存在遗传变化,以及基因频率是否与氧化应激相关。

利用系谱信息(AGAMA)和基因组数据(ThermoFisher Ovine 50K SNP芯片)估计遗传趋势(BLUPF90),并检查与活力、ROS产生、脂质过氧化相关的候选基因(如PDCD1、ATP2B1、SMOX等)的等位基因和基因型频率变化。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
Biladyl®冷冻稀释液Minitube--
YO-PRO-1碘化物ThermoFisher Scientific--
碘化丙啶ThermoFisher Scientific--
Hoechst 33342ThermoFisher Scientific--
CM-H2DCFDAThermoFisher Scientific--
C11-BODIPY 581/591ThermoFisher Scientific--
吖啶橙Polysciences, Inc., USA--
CytoFlex S流式细胞仪Beckman Coulter, Inc., USA--
Cytomics FC-500流式细胞仪Beckman Coulter, Inc., USA--
羊50K SNP芯片ThermoFisher Scientific--
ARPEGE 170液氮容器Air Liquide Healthcare--
IceCube14S-Ver. 1.30可编程生物冷冻仪SY-Laboratory Geräte GmbH, Minitüb®, Germany--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
样本选择与冷冻保存
样本来源:145只公羊,来自曼切加羊种质库,涵盖7个世代;冷冻条件:Biladyl®稀释液,最终浓度200×10^6精子/mL,降温曲线-20°C/min至-100°C和-10°C/min至-140°C;储存时间最长25年;解冻条件:37°C,30秒。
阅读提示:Materials and methods: Sperm collection and experimental design
精子质量检测
检测试剂:YO-PRO-1(0.04 μM)、PI(3 μM)、CM-H2DCFDA(0.2 μM)、C11-BODIPY(0.02 μM);孵育条件:37°C,黑暗中;流式细胞仪:CytoFlex S(Beckman Coulter),405nm和488nm激光,检测10,000个细胞;时间点:解冻后0小时和2小时。
阅读提示:Materials and methods: Fluorescence probes for sperm physiology analysis; Flow cytometry analysis
SCSA染色质完整性分析
SCSA方法:TNE缓冲液稀释至2×10^6细胞/mL,酸变性30秒,AO染色后3分钟流式分析;%DFI和%HDS计算方法。
阅读提示:Materials and methods: Sperm chromatin integrity assessment
遗传分析
系谱数据来源:AGAMA;基因组数据:ThermoFisher Ovine 50K SNP芯片;遗传趋势使用BLUPF90套件,标准化为SD;候选基因:表1中列出的基因。
阅读提示:Materials and methods: Statistical analysis; Table 1