样本选择与冷冻保存
获取不同世代(储存时间)的曼切加公羊冷冻精液样本,以评估氧化应激的影响。
从曼切加羊种质库中选取145只公羊的冷冻精液样本,涵盖7个世代,所有样本均在相同年龄(3-3.5岁)和相同条件下采集、冷冻(Biladyl®稀释液,浓度200×10^6精子/mL,程序降温),储存于液氮中。
Effects of long-term cryopreservation on sperm quality and oxidative stress in Manchega rams (Ovis aries)
研究包含精子样本分析(流式细胞术、SCSA)和遗传趋势分析(系谱与基因组),但无功能验证或机制实验,属于观察性研究。
曼切加羊冷冻精液样本(来自145只公羊,储存长达25年) 曼切加羊种质库中的系谱与基因组数据
样本量:145只公羊,涵盖7个世代,来自曼切加羊品种种质库 精子样本冷冻保存条件:使用Biladyl®冷冻稀释液,浓度400×10^6精子/mL稀释至200×10^6精子/mL,降温曲线-20°C/min至-100°C,-10°C/min至-140°C 检测时间点:解冻后0小时和2小时(37°C孵育) 检测指标:精子活力(YO-PRO-1/PI)、凋亡样变化、ROS产生(CM-H2DCFDA)、脂质过氧化(C11-BODIPY)、染色质完整性(SCSA®,%DFI和%HDS) 统计分析:回归模型,世代固定效应(分类和二次多项式),孵育时间,公羊效应随机;遗传趋势使用BLUPF90估计
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取不同世代(储存时间)的曼切加公羊冷冻精液样本,以评估氧化应激的影响。
从曼切加羊种质库中选取145只公羊的冷冻精液样本,涵盖7个世代,所有样本均在相同年龄(3-3.5岁)和相同条件下采集、冷冻(Biladyl®稀释液,浓度200×10^6精子/mL,程序降温),储存于液氮中。
测量解冻后不同时间点的精子活力、ROS产生、脂质过氧化和染色质完整性,以评估氧化应激水平。
使用流式细胞术(CytoFlex S)检测精子活力(YO-PRO-1/PI)、ROS产生(CM-H2DCFDA)和脂质过氧化(C11-BODIPY),使用SCSA®法检测染色质完整性(%DFI和%HDS),分别在解冻后0小时和2小时(37°C孵育)进行。
评估精子质量参数是否存在遗传变化,以及基因频率是否与氧化应激相关。
利用系谱信息(AGAMA)和基因组数据(ThermoFisher Ovine 50K SNP芯片)估计遗传趋势(BLUPF90),并检查与活力、ROS产生、脂质过氧化相关的候选基因(如PDCD1、ATP2B1、SMOX等)的等位基因和基因型频率变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 精子冷冻保存 | Biladyl®冷冻稀释液 | Minitube | -- |
| 精子活力检测 | YO-PRO-1碘化物 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 碘化丙啶 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 精子生理分析 | Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | -- |
| ROS检测 | CM-H2DCFDA | ThermoFisher Scientific | -- |
| 脂质过氧化检测 | C11-BODIPY 581/591 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 染色质完整性检测 | 吖啶橙 | Polysciences, Inc., USA | -- |
| 流式细胞术 | CytoFlex S流式细胞仪 | Beckman Coulter, Inc., USA | -- |
| SCSA分析 | Cytomics FC-500流式细胞仪 | Beckman Coulter, Inc., USA | -- |
| SNP基因分型 | 羊50K SNP芯片 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 样品冷冻保存 | ARPEGE 170液氮容器 | Air Liquide Healthcare | -- |
| 冷冻保存 | IceCube14S-Ver. 1.30可编程生物冷冻仪 | SY-Laboratory Geräte GmbH, Minitüb®, Germany | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本选择与冷冻保存 | 样本来源:145只公羊,来自曼切加羊种质库,涵盖7个世代;冷冻条件:Biladyl®稀释液,最终浓度200×10^6精子/mL,降温曲线-20°C/min至-100°C和-10°C/min至-140°C;储存时间最长25年;解冻条件:37°C,30秒。 阅读提示:Materials and methods: Sperm collection and experimental design |
| 精子质量检测 | 检测试剂:YO-PRO-1(0.04 μM)、PI(3 μM)、CM-H2DCFDA(0.2 μM)、C11-BODIPY(0.02 μM);孵育条件:37°C,黑暗中;流式细胞仪:CytoFlex S(Beckman Coulter),405nm和488nm激光,检测10,000个细胞;时间点:解冻后0小时和2小时。 阅读提示:Materials and methods: Fluorescence probes for sperm physiology analysis; Flow cytometry analysis |
| SCSA染色质完整性分析 | SCSA方法:TNE缓冲液稀释至2×10^6细胞/mL,酸变性30秒,AO染色后3分钟流式分析;%DFI和%HDS计算方法。 阅读提示:Materials and methods: Sperm chromatin integrity assessment |
| 遗传分析 | 系谱数据来源:AGAMA;基因组数据:ThermoFisher Ovine 50K SNP芯片;遗传趋势使用BLUPF90套件,标准化为SD;候选基因:表1中列出的基因。 阅读提示:Materials and methods: Statistical analysis; Table 1 |