检测穿孔素在病变和引流淋巴结的组织特异性表达
验证穿孔素表达是否仅限于利什曼病感染的皮肤。
感染硕大利什曼原虫的小鼠，2周后通过流式细胞术分析引流淋巴结和病变中CD8 T细胞的穿孔素和颗粒酶B表达。
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低氧与IL-15协同诱导CD8 T细胞穿孔素表达并促进小鼠皮肤利什曼病的皮肤损伤
Hypoxia and IL-15 Cooperate to Induce Perforin Expression by CD8 T Cells and Promote Damage to the Skin in Murine Cutaneous Leishmaniasis
实验完整度
高包含体外细胞培养、小鼠感染模型、流式细胞术、qPCR及单细胞RNA测序分析，并进行了功能验证（穿孔素抑制剂治疗）和机制验证（Blimp-1缺陷、IL-15/低氧协同）。
主要模型
硕大利什曼原虫感染的小鼠模型（C57BL/6、Blimp-1cKO、RAG-/-重建CD8 T细胞） 巴西利什曼原虫感染的RAG-/-重建CD8 T细胞小鼠模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDM）
重点核对
低氧条件（1% O2）和IL-15（50 ng/mL）处理对穿孔素表达的影响 Blimp-1缺陷（Blimp-1cKO）对低氧诱导穿孔素表达的影响 SN34960给药途径（腹腔注射100 mg/kg，局部外用0.05%凝胶）及方案 感染时间点及处理时长（感染后3周开始治疗，持续至5周）
摘要
皮肤利什曼病是由利什曼原虫属原生动物寄生虫引起的一种疾病，虽然寄生虫影响疾病严重程度，但细胞毒性CD8 T细胞反应介导对感染皮肤的损伤。我们发现，细胞毒性蛋白穿孔素仅在CD8 T细胞被招募到利什曼病感染的皮肤后才表达，提示病变内的炎症信号诱导了穿孔素。在这里，利用硕大利什曼原虫感染的小鼠模型，我们证明了穿孔素的表达是由低氧和IL-15共同驱动的，这两种信号均存在于利什曼病感染的皮肤微环境中。我们还证明了皮肤利什曼病病变中Il15 mRNA的主要来源是中性粒细胞和巨噬细胞，并且在体外暴露于低氧的巨噬细胞产生更多的Il15。由于穿孔素仅在病变中表达，我们将一种小分子穿孔素抑制剂重新配方用于局部应用，并发现局部抑制穿孔素足以改善已建立的皮肤利什曼病。因此，局部穿孔素抑制可被视为皮肤利什曼病患者以及其他以细胞毒性CD8 T细胞参与疾病发病机制为特征的炎症性皮肤病患者的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 皮肤利什曼病中，损伤性CD8 T细胞的穿孔素表达是由何种微环境信号诱导的？以及局部抑制穿孔素能否改善疾病？
- 核心机制
- 低氧和IL-15协同诱导CD8 T细胞表达穿孔素，此过程独立于Blimp-1；病变内的巨噬细胞和中性粒细胞是Il15的主要来源，且低氧可上调巨噬细胞Il15表达。
- 主要证据
- 流式细胞术显示病变中穿孔素表达仅限于皮肤，FTY720阻断淋巴细胞输出实验排除优先招募；体外低氧和IL-15处理上调穿孔素表达，且Blimp-1cKO不影响；单细胞RNA-seq鉴定Il15来源；SN34960全身或局部治疗减少病变大小，不改变寄生虫载量。
- 研究意义
- 揭示了低氧诱导穿孔素表达的机制，并展示局部抑制穿孔素作为CD8 T细胞介导皮肤病的潜在治疗策略，特别是与抗寄生虫药物联合用于皮肤利什曼病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FTY720处理以排除优先招募
确定穿孔素表达细胞是皮肤微环境诱导还是由淋巴结选择性招募。
感染后2天开始每日腹腔注射FTY720或对照，持续10天，分析引流淋巴结和病变中CD8 T细胞穿孔素表达。
体外低氧刺激CD8 T细胞
评估低氧是否足以诱导CD8 T细胞表达颗粒酶B和穿孔素。
从感染小鼠的引流淋巴结制备单细胞悬液，用抗CD3和抗CD28刺激，在常氧（21% O2）或低氧（1% O2）下培养48小时后流式检测颗粒酶B和穿孔素表达。
验证穿孔素诱导是否依赖Blimp-1
确定低氧诱导穿孔素是否与颗粒酶B一样依赖转录因子Blimp-1。
使用Blimp-1cKO和WT小鼠感染硕大利什曼原虫，比较病变大小、寄生虫数量及CD8 T细胞中颗粒酶B和穿孔素表达；同时体外培养WT和Blimp-1cKO细胞在低氧下检测。
检测IL-15与低氧协同诱导穿孔素
验证IL-15是否与低氧协同促进CD8 T细胞穿孔素表达。
引流淋巴结单细胞在常氧或低氧下刺激，并加入IL-15、IL-2或JAK1/3抑制剂tofacitinib，48小时后流式检测穿孔素。
鉴定Il15来源及低氧对其表达的影响
确定病变中Il15的来源细胞，并探究低氧是否能诱导巨噬细胞Il15表达。
利用公开的单细胞RNA-seq数据分析病变皮肤中Il15表达细胞类型；培养BMDM，在常氧或低氧下孵育24小时，qPCR检测Il15 mRNA。
体内评估穿孔素抑制剂的治疗效果
验证全身及局部应用穿孔素抑制剂SN34960能否减轻CD8 T细胞介导的皮肤病理。
使用RAG-/-小鼠感染巴西利什曼原虫并重建CD8 T细胞，3周后给予SN34960腹腔注射或局部凝胶治疗，测量耳厚度、寄生虫载量和中性粒细胞浸润。
在治愈型C57BL/6小鼠中验证穿孔素抑制剂疗效
评估穿孔素抑制在自愈模型中的疗效及对寄生虫控制的影响。
感染硕大利什曼原虫的C57BL/6小鼠，在病变出现后给予SN34960全身或局部治疗，测量病变大小和寄生虫载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
检测穿孔素和颗粒酶B表达
验证穿孔素表达的组织特异性
体外低氧刺激
检测Il15表达
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Sigma | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | -- | |
| ACK裂解液 | Gibco | -- | |
| 寄生虫培养 | Schneider昆虫培养基 | GIBCO | -- |
| 组织消化 | Liberase TL | Roche Diagnostics | -- |
| DNA酶I | Sigma | -- | |
| gentleMACS组织解离器（带加热器） | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞分离 | 细胞过滤器 | BD Pharmingen | -- |
| CD8 T细胞分选试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞刺激 | 抗CD3抗体（克隆145-2C11） | Invitrogen | -- |
| 抗CD28抗体（克隆37.51） | Invitrogen | -- | |
| 白细胞介素-15 | Biolegend | 566304 | |
| 白细胞介素-2 | Hoffman La-Roche | Ro | |
| 托法替尼 | Selleckchem | CP-690550 | |
| 低氧培养 | 调模式培养箱室 | Billups-Rothenberg | -- |
| Baker Ruskin InvivO2 400低氧培养箱 | Baker Ruskin | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒（aqua） | Thermo Fisher | L34957 |
| LIVE/DEAD可固定死细胞染色试剂盒（blue） | Thermo Fisher | L23105 | |
| eBioscience可固定活力染料eFluor-780 | Thermo Fisher | 65-0865-14 | |
| 抗CD45抗体（克隆30-F11） | Invitrogen, BioLegend | 47-0451-82, | |
| 抗颗粒酶B抗体（克隆GB11） | Invitrogen | GRB05, | |
| 抗CD11b抗体（克隆M1/70） | Invitrogen | 48-0112-82 | |
| 抗CD3抗体（克隆17A2） | BD Biosciences | 741319 | |
| 抗CD44抗体（克隆IM7） | BD Biosciences | 751414 | |
| 抗CD8β抗体（克隆YTS156.7.7） | BioLegend | 126610, | |
| 抗Ly6G抗体（克隆1A8） | BioLegend | 127614 | |
| 抗穿孔素抗体（克隆S16009A） | BioLegend | 154304 | |
| BD FACSymphony A3流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cytek Aurora 4激光流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| qPCR | NucleoSpin RNA Mini试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| iScript逆转录预混液 | Bio-Rad | -- | |
| ABS Proflex热循环仪 | Thermo Fisher | -- | |
| C1000 RT-PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| 药物处理 | FTY720 | Cayman Chemical | -- |
| SN34960 | -- | -- | |
| β-环糊精 | -- | -- | |
| 羟丙基甲基纤维素 | -- | -- | |
| 2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇 | Gattefosse | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 感染模型建立 | 寄生虫种类、剂量、感染途径、小鼠品系和年龄 阅读提示：Materials & Methods: Parasites, Mice；结果中描述感染细节 |
| 体外刺激 | 抗CD3/CD28浓度、低氧浓度、IL-15/IL-2浓度、tofacitinib浓度、培养时间 阅读提示：Materials & Methods: In vitro stimulation |
| 体内药物处理 | SN34960剂量、给药途径（腹腔 vs 局部）、给药频率、开始时间、持续时间 阅读提示：Materials & Methods: In vivo drug treatment；Figure 6示意图 |
| Blimp-1缺陷验证 | 小鼠基因型、Cre品系、对照选择 阅读提示：Materials & Methods: Mice；Figure 3图注 |
| 体外低氧培养 | 氧气浓度、培养时间、细胞类型 阅读提示：Materials & Methods: Cell culture under hypoxic conditions |