转录组测序筛选差异circRNA
鉴定LSCC中异常表达的circRNA。
对57对LSCC及配对癌旁正常黏膜组织进行circRNA测序，筛选出上调的circRNAs，并通过RT-PCR和Sanger验证。
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环状RNA circCORO1C通过调控let-7c-5p/PBX3轴促进喉鳞状细胞癌进展
Circular RNA circCORO1C promotes laryngeal squamous cell carcinoma progression by modulating the let-7c-5p/PBX3 axis
实验完整度
高结合临床组织测序分析、体外细胞功能实验（增殖、迁移、侵袭、凋亡）、体内异种移植瘤模型以及分子机制验证（RIP、荧光素酶、Western blot）等多个证据层级。
主要模型
喉鳞状细胞癌细胞系FD-LSC-1和TU-177 BALB/c裸鼠异种移植瘤模型 喉鳞状细胞癌患者组织样本（含配对癌旁正常黏膜）
重点核对
circCORO1C在LSCC组织和细胞系中的表达水平 si-circCORO1C敲低效率及对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响 circCORO1C与let-7c-5p的直接结合及调控关系 let-7c-5p对靶基因PBX3的调控作用 circCORO1C-let-7c-5p-PBX3轴在体内肿瘤生长中的功能
摘要
背景：喉鳞状细胞癌（LSCC）是头颈部常见的恶性肿瘤。LSCC患者的声音、呼吸和吞咽功能严重受损，预后差。环状RNA（circRNA）在癌症研究中引起了广泛关注。然而，circRNA在LSCC中的表达模式和功能仍 largely unknown。方法：对57对LSCC及配对的癌旁正常黏膜组织进行RNA测序，构建circRNA、miRNA和mRNA表达谱。采用RT-PCR、qPCR、Sanger测序和FISH研究circCORO1C在LSCC组织和细胞中的表达、定位及临床意义。通过RNAi介导的敲低、增殖分析、EdU染色、集落形成实验、Transwell实验和凋亡分析研究circCORO1C在LSCC中的功能。通过荧光素酶实验、RNA免疫沉淀、western blotting和免疫组织化学研究circCORO1C、let-7c-5p和PBX3之间的调控机制。结果：circCORO1C在LSCC组织和细胞中高表达，且其高表达与LSCC的恶性进展和不良预后密切相关。敲低circCORO1C抑制了LSCC细胞的增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤形成。机制研究表明，circCORO1C竞争性结合let-7c-5p，阻止其降低PBX3水平，从而促进上皮-间质转化，最终促进LSCC的恶性进展。结论：circCORO1C在LSCC进展中具有致癌作用，可能作为LSCC治疗的新靶点。circCORO1C表达有潜力作为LSCC检测的新型诊断和预后生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circCORO1C在喉鳞状细胞癌中的表达、功能及分子机制是什么？
- 核心机制
- circCORO1C作为竞争性内源RNA海绵吸附let-7c-5p，解除let-7c-5p对PBX3的抑制作用，促进EMT，从而促进LSCC的恶性进展。
- 主要证据
- circCORO1C在LSCC组织和细胞中高表达，敲低circCORO1C抑制细胞增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长；RIP、RNA pull-down和荧光素酶报告实验证实circCORO1C与let-7c-5p结合，let-7c-5p靶向PBX3；过表达PBX3可逆转circCORO1C敲低效应。
- 研究意义
- circCORO1C可能作为LSCC的新靶点和诊断、预后生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circCORO1C表达和稳定性验证
验证circCORO1C在LSCC中的表达特征。
通过qPCR检测circCORO1C在LSCC组织及细胞系中的表达；通过RNase R处理和放线菌素D实验验证其稳定性。
体外功能实验
研究circCORO1C对LSCC细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
用siRNA敲低circCORO1C后，通过CCK-8、EdU染色、集落形成、Transwell和流式凋亡实验检测细胞功能。
分子机制验证
验证circCORO1C作为miRNA海绵与let-7c-5p的相互作用。
通过RIP、荧光素酶报告基因实验和qPCR验证circCORO1C与let-7c-5p的结合及调控关系。
let-7c-5p功能及靶标验证
探索let-7c-5p在LSCC中的作用并验证其靶基因。
使用miRNA mimics或inhibitor调控let-7c-5p水平，检测其对细胞功能的影响，并通过荧光素酶实验验证其直接靶向PBX3 3'UTR。
回补与表型恢复实验
证明circCORO1C通过let-7c-5p/PBX3轴发挥功能。
在敲低circCORO1C的基础上同时使用let-7c-5p inhibitor或过表达PBX3，观察对细胞恶性表型的影响。
体内异种移植瘤模型
验证circCORO1C在体内的促肿瘤作用。
将稳定敲低circCORO1C的FD-LSC-1细胞皮下注射到裸鼠，测量肿瘤体积和重量，并对肿瘤组织进行IHC和qPCR检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | BEGM™支气管上皮细胞生长培养基 | Lonza | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| MEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | -- |
| PARIS试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN Biotech | -- | |
| RNA测序 | Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina HiSeq 4000测序仪 | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| RT-PCR | HiScript II 一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| All-in-One™ miRNA一链cDNA合成试剂盒 | GeneCopoeia | -- | |
| qPCR | ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| ABI Stepone Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| RNA稳定性 | RNase R | Geneseed Biotech | -- |
| RNA纯化 | RNeasy MinElute回收试剂盒 | Qiagen | -- |
| 琼脂糖凝胶电泳 | 100 bp DNA分子量标准 | TransGen Biotech | -- |
| Azure C600成像仪 | Azure Biosystems | -- | |
| FISH | FISH试剂盒 | RiboBio | -- |
| Leica TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 载体构建 | p3×FLAG-CMV-10载体 | Sigma-Aldrich | -- |
| pLKO.1载体 | -- | -- | |
| psiCHECK-2载体 | Promega | -- | |
| 细胞转染 | 针对circCORO1C的siRNA #1 | GenePharma | -- |
| 针对circCORO1C的siRNA #2 | GenePharma | -- | |
| let-7c-5p模拟物 | GenePharma | -- | |
| let-7c-5p抑制剂 | GenePharma | -- | |
| 阴性对照抑制剂 | GenePharma | -- | |
| 慢病毒生产 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 细胞活力检测 | TransDetect CCK试剂 | TransGen Biotech | -- |
| Spectra Max i3x多功能酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 增殖检测 | EdU试剂 | RiboBio | -- |
| Hoechst 33342染料 | -- | -- | |
| ImageXpress高内涵筛选系统 | Molecular Devices | -- | |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD Biosciences | -- |
| 凋亡检测 | 死细胞凋亡检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- |
| Alexa Fluor 488 膜联蛋白V | -- | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| NovoCyte流式细胞仪 | ACEA Biosciences | -- | |
| RIP | Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| AGO2抗体 | CST | 2897 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Coomassie (Bradford) 蛋白质定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| PBX3抗体 | Proteintech | 12571-1-AP | |
| E-cadherin抗体 | CST | 3195S | |
| N-cadherin抗体 | CST | 13116S | |
| Vimentin抗体 | CST | 5741S | |
| Slug抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166476 | |
| GAPDH抗体 | TransGen Biotech | HC301-02 | |
| Western Bright ECL HRP底物 | Advansta Inc. | -- | |
| 异种移植 | BALB/C裸鼠 | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | -- |
| IHC | DAB显色剂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| circCORO1C表达和临床相关性分析 | qPCR验证的组织样本数量（107对），TNM分期标准（AJCC第8版），统计方法（Pearson相关，Kaplan-Meier生存分析） 阅读提示：Methods 'LSCC patient tissue' 和 'RNA and genomic DNA (gDNA) extraction'，Figure legends 1g–k |
| 体外功能实验（敲低circCORO1C） | 转染的siRNA序列和浓度，CCK-8细胞接种数（3×10^3），EdU处理浓度（50 μM）和时间（2h），Transwell细胞数（迁移4×10^4，侵袭1×10^5），凋亡检测方法（Annexin V/PI） 阅读提示：Methods 'siRNAs, miRNA mimics, and inhibitor', 'CCK8 assay', '5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining', 'Transwell migration and invasion assays', 'Apoptosis analysis' |
| 机制验证（circCORO1C/let-7c-5p/PBX3） | RIP实验使用的AGO2抗体，荧光素酶报告载体的构建（野生型和突变型），细胞共转染条件（HEK293T） 阅读提示：Methods 'RNA immunoprecipitation (RIP)', 'Luciferase reporter assay', 'Plasmid construction and cell transfection' |
| 体内异种移植实验 | 动物品系、性别、周龄（BALB/C裸鼠 6-8周龄），注射细胞数（2×10^6），肿瘤测量时间（每3天），处死时间（25天），每组样本量（n=6），统计方法 阅读提示：Methods 'Xenograft tumorigenesis'，Figure legends 8a–b |