细胞分选与样本制备
分离特定T细胞亚群以进行多组学分析。
从人类皮肤和血液中分选出CD4+ Treg和Tconv细胞亚群，包括CD45RA+ Treg、CCR8+ Treg、皮肤Treg等。
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DNA低甲基化特征定义人类皮肤组织调节性T细胞并鉴定其血液再循环对应细胞
DNA hypomethylation traits define human regulatory T cells in cutaneous tissue and identify their blood recirculating counterparts
实验完整度
高整合了全基因组甲基化、染色质可及性和基因表达等多组学分析，并结合了CRISPRa功能验证和动物模型实验，提供了多层次的证据。
主要模型
人类皮肤Treg细胞 人类血液CCR8+ Treg细胞 人类皮下脂肪Treg细胞 Kaede小鼠皮肤Treg细胞
重点核对
样本来源：9名健康女性供体的皮肤和血液（Tissue Donors 7, 10, 11; Blood Donors 3-8）。 细胞分选：基于流式细胞术分选特定T细胞亚群，包括CD45RA+ Treg、CCR8+ Treg、皮肤Treg等。 DNA甲基化测序：全基因组重亚硫酸盐测序，中位覆盖度2-7×。 转录因子活性验证：使用CRISPRa系统激活c-Myc结合位点，检测MLPH和GNA11表达。
摘要
组织中的CD4+调节性T（Treg）细胞发挥关键的免疫调节和再生作用。尽管它们很重要，但人类组织Treg细胞的表观遗传学和分化尚未完全了解。在这里，我们对来自皮肤和血液的人类Treg细胞进行了全基因组DNA甲基化分析，并将这些数据整合到一个多组学框架中，包括染色质可及性和基因表达。该分析确定了控制皮肤Treg细胞组织适应的程序。我们发现转座因子亚家族代表了组织Treg细胞低甲基化景观的主要组成部分。基于T细胞抗原受体序列和DNA低甲基化同源性，我们的数据表明血液CCR8+ Treg细胞包含再循环的人类皮肤Treg细胞。相反，染色质可及性和基因表达的差异表明在再循环过程中组织适应程序发生了一定程度逆转。我们的发现提供了对人类组织Treg细胞生物学的见解，这可能有助于利用这些细胞进行治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类皮肤组织Treg细胞的表观遗传特征及其与血液CCR8+ Treg细胞的关系。
- 核心机制
- 组织Treg细胞适应涉及广泛的DNA低甲基化，特别是转座因子亚家族，这些可能充当增强子。血液CCR8+ Treg细胞保留了组织Treg细胞的甲基化特征，但染色质可及性和基因表达部分逆转，表明再循环过程中组织适应程序发生逆转。
- 主要证据
- 通过比较皮肤和血液Treg细胞的DNA甲基化、染色质可及性和基因表达，发现皮肤Treg细胞与血液CCR8+ Treg细胞在甲基化水平上高度相似，但可及性和表达差异较大；通过TCR序列分析发现共享克隆；在Kaede小鼠中验证了皮肤Treg细胞向淋巴结的再循环。
- 研究意义
- 揭示了人类组织Treg细胞的生物学特性，为治疗性应用和疾病诊断提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
全基因组DNA甲基化分析
比较不同T细胞亚群的DNA甲基化谱，鉴定差异甲基化区域。
对分选的细胞进行全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS），分析甲基化水平。
多组学整合分析
整合甲基化、染色质可及性和基因表达数据，鉴定DMR-peak-gene链接。
使用公开的scATAC-seq和RNA-seq数据，与WGBS数据整合，分析差异甲基化区域（DMR）、差异可及峰和差异表达基因之间的关联。
转录因子基序分析
鉴定与皮肤Treg细胞组织适应相关的转录因子。
分析DMR和差异可及峰中富集的转录因子基序，并评估其靶基因的转录组足迹。
CRISPRa功能验证
验证c-Myc结合位点的增强子潜力。
在人类原代Treg细胞中使用CRISPRa系统激活MLPH和GNA11的c-Myc结合位点，检测基因表达变化。
小鼠体内追踪实验
验证CCR8+ Treg细胞是否包含再循环的组织Treg细胞。
使用Kaede转基因小鼠，光转换皮肤后检测皮肤引流淋巴结中Kaede-red+ Treg细胞的CCR8表达。
转座因子分析
分析转座因子在组织Treg细胞低甲基化景观中的作用。
评估TE亚家族在DMR中的富集，分析TE插入位点的甲基化和可及性，并分析TE表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
DNA甲基化分析
染色质可及性分析
功能验证
体内追踪
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞消化 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 11284932001 | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi | 130-090-101 | |
| 细胞分选 | 抗人CD4抗体 | Biolegend | 317406 |
| 抗人CD8抗体 | Biolegend | 300904 | |
| 抗人CD25抗体 | Biolegend | 302606 | |
| DNA提取 | DNA/RNA微量提取试剂盒 | Qiagen | 80284 |
| RNA-seq | SMART-Seq链特异性试剂盒 | Takara | 634444 |
| NextSeq 500/550高输出试剂盒v2.5 | Illumina | -- | |
| WGBS | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32851 |
| TapeStation 4200 | Agilent | 5067-5365 | |
| 甲基化验证 | EpiTec重亚硫酸盐转化试剂盒 | Qiagen | 59104 |
| KAPA HiFi热启动预混液 | Roche | 7959079001 | |
| CRISPRa | dCas9-VP64 | -- | -- |
| innuPREP RNA微量提取试剂盒 | Analytik Jena | -- | |
| TaqMan探针 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Viia7实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | Kaede小鼠 | -- | -- |
| CoolLED灯 | AHF | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞分选 | 样本来源：健康供体的皮肤和血液；分选的细胞亚群及表面标志物（如CD4, CD25, CD127, CD45RA, CCR8等）；分选纯度。 阅读提示：Methods 'FACS of T cells from blood and skin' |
| 全基因组甲基化测序 | DNA提取方法；文库构建方法；测序平台和读长；测序深度。 阅读提示：Methods 'Whole-genome bisulfite sequencing' |
| 多组学整合分析 | scATAC-seq数据的来源和处理；RNA-seq数据的处理；DMR、差异可及峰和差异表达基因的阈值。 阅读提示：Methods 'Differential methylation analysis', 'Differential peak accessibility analysis in scATAC-seq data', 'Differential expression analysis of RNA-seq data' |
| CRISPRa功能验证 | Treg细胞的分离和培养；转导效率；引导RNA序列；培养时间；基因表达检测方法。 阅读提示：Methods 'CRISPR-based transcriptional activation of MLPH and GNA11' |
| 小鼠实验 | 小鼠品系和年龄；光转换条件；淋巴结取材时间；CCR8表达的检测。 阅读提示：Methods 'Origin, treatment and analyses of Kaede-expressing mice' |