建立抑郁合并AD模型
探究抑郁对AD病理的影响
在3月龄5×FAD和WT小鼠上建立习得性无助（LH）抑郁模型，包括在穿梭箱中进行3天不可避免足部电击训练，随后进行25次可逃避电击测试，根据逃避失败次数分组为LH+和LH-。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抑郁通过乳酸依赖的微胶质Kv1.3激活促进含Aβ外泌体的扩散，加剧AD病理
Depression exacerbates AD pathology through lactate-dependent activation of microglial Kv1.3 to promote Aβ-containing exosome spreading
实验完整度
高包含体内动物模型（5×FAD抑郁模型）、体外原代微胶质培养、电生理记录、外泌体分析及条件性敲除验证，涵盖行为学、病理学和机制验证。
主要模型
5×FAD小鼠 原代微胶质细胞 急性脑片微胶质
重点核对
小鼠品系：5×FAD、C57BL/6、cx3cr1-CreER;YFP、TMEM119-Cre、KCNA3 fl/fl 抑郁模型：习得性无助（LH）模型，0.3 mA足部电击，3天训练 微胶质Kv1.3条件性敲除（cKO）及对照（f/f） 乳酸处理浓度：2 mM或4 mM（体外），0.1 mM ICV注射（体内） Kv1.3抑制剂PAP-1浓度：200 nM
摘要
抑郁症已被广泛认为是加速阿尔茨海默病（AD）患者认知衰退的重要促进因素。先前研究表明，微胶质介导的神经炎症是抑郁症和痴呆症病因中的常见关键事件，但微胶质是否以及如何参与抑郁加剧AD病理的过程尚不清楚。通过在5×FAD小鼠上建立习得性无助抑郁模型，我们证实抑郁确实能促进Aβ斑块沉积并恶化AD小鼠的认知表现。重要的是，我们发现抑郁AD脑中微胶质的乳酸浓度显著升高，可能通过非直接乳酰化作用激活钾通道Kv1.3。激活的Kv1.3进一步促进Aβ斑块附近微胶质中含Aβ外泌体向周围脑组织的扩散。值得注意的是，微胶质中条件性敲除Kv1.3可以逆转抑郁诱导的AD病理加速和认知衰退。总之，我们的研究强调了微胶质Kv1.3在抑郁加剧AD病理背景下促进Aβ传播的重要功能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 抑郁症是否以及如何加剧阿尔茨海默病（AD）的病理进展？
- 核心机制
- 抑郁促进微胶质糖酵解产生乳酸，乳酸通过非直接乳酰化机制激活Kv1.3通道，进而促进含Aβ外泌体的释放和传播，加剧Aβ病理和认知衰退。
- 主要证据
- 在5×FAD小鼠上建立LH抑郁模型，发现抑郁加剧Aβ沉积和认知缺陷；微胶质乳酸水平升高，Kv1.3表达和活性增加；Kv1.3 cKO或PAP-1抑制可减少外泌体释放，改善病理；乳酸注射可模拟抑郁效应，且被Kv1.3 cKO逆转。
- 研究意义
- 该研究揭示了微胶质Kv1.3在抑郁加剧AD病理中的关键作用，为AD治疗提供了靶向微胶质代谢和Kv1.3激活的潜在干预策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
行为学测试
评估抑郁对AD小鼠认知功能的影响
通过Y迷宫和Morris水迷宫测试评估空间工作记忆和学习记忆能力。
病理检测Aβ沉积
评估抑郁对Aβ斑块沉积的影响
采用硫黄素S（TS）染色检测脑内Aβ斑块，比较AD-LH+、AD-LH-和AD-Unshock小鼠的Aβ沉积。
微胶质形态和Kv1.3表达分析
检测抑郁状态下微胶质激活状态及Kv1.3表达变化
通过Iba1免疫染色分析微胶质形态学，通过Kv1.3免疫染色分析斑块相关微胶质（PAM）和非斑块相关微胶质（NPAM）中Kv1.3表达水平。
微胶质代谢和乳酸检测
检测抑郁对微胶质糖酵解和乳酸产生的影响
通过免疫染色检测PKM2表达，通过磁珠分选分离微胶质，并使用乳酸测定试剂盒测量微胶质内的乳酸水平。
体外乳酸刺激实验
验证乳酸对微胶质Kv1.3表达和电流的影响
培养原代微胶质，用2 mM或4 mM乳酸处理，通过免疫染色和全细胞膜片钳记录检测Kv1.3表达和钾电流。
急性脑片电生理记录
在脑片水平验证乳酸对微胶质Kv1.3通道的激活作用
制备急性脑片，用2 mM乳酸孵育2小时，通过全细胞记录检测微胶质外向整流钾电流，并用Kv1.3特异性拮抗剂PAP-1（200 nM）验证其参与。
微胶质Kv1.3条件性敲除实验
验证Kv1.3在抑郁加剧AD病理中的作用
通过KCNA3 fl/fl小鼠与cx3cr1-CreER;YFP和5×FAD小鼠杂交，获得微胶质特异性Kv1.3敲除（cKO;AD）和对照（f/f;AD）小鼠，建立LH模型后腹腔注射他莫昔芬诱导敲除，然后进行行为学、Aβ病理分析。
体内乳酸注射实验
验证乳酸是否通过Kv1.3加剧AD病理
对f/f;AD和cKO;AD小鼠进行侧脑室注射乳酸（0.1 mM）或ACSF，连续14天，然后进行Y迷宫测试和Aβ病理分析。
外泌体分离与表征
验证乳酸激活Kv1.3促进含Aβ外泌体释放
从原代微胶质培养上清中分离外泌体，通过Western blot检测Aβ和TSG101，通过NTA分析外泌体大小和浓度，并通过免疫荧光分析Aβ与TSG101的共定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | KCNA3 fl/fl小鼠 | Cyagen Biosciences | -- |
| TMEM119-Cre小鼠 | Shanghai Model Organisms | -- | |
| 质粒构建 | pBlueScriptR-KCNA3载体 | MIAO LING BIOLOGY | P11561 |
| pEGFP-C2载体 | MIAO LING BIOLOGY | P0135 | |
| 抑郁模型建立 | 穿梭箱 | MED-associates | -- |
| 行为学测试 | 动物行为分析系统 | Shanghai Jiliang Software Technology Co | -- |
| EthoVision XT软件 | -- | -- | |
| 微胶质分离 | 成年脑组织解离试剂盒 | RWD | DHABE-5003 |
| EasySep™小鼠CD11b阳性选择试剂盒II | STEMCELL | 18770 | |
| 乳酸检测 | 乳酸测定试剂盒 | Abcam | 65330 |
| 流式分析 | CD11b抗体 | Biolegend | 101211 |
| 流式细胞仪 | BD | LSRFortessa X-20 | |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | Aβ1-42肽 | QYAOBIO | 04010011526 |
| 电生理记录 | 振动切片机 | Leica Microsystems | -- |
| 正置固定载物台显微镜 | Nikon | Eclipse FN1 | |
| 放大器 | HEKA | EPC-10 USB | |
| Fitmaster软件 | HEKA | -- | |
| Clampfit 12软件 | Molecular Devices | -- | |
| ICV注射 | 立体定位仪 | RWD | -- |
| 微量注射泵 | Chemyx | -- | |
| 外泌体分离 | 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima XPN-100 |
| 外泌体表征 | 透射电子显微镜 | Hitachi | H-7650 |
| 纳米颗粒跟踪系统 | Particle Metrix | Zeta View | |
| 蛋白质分析 | Jess全自动蛋白质定量系统 | Protein Simple | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| NP-40裂解液 | APEXBIO | K1127 | |
| 蛋白酶抑制剂 | APEXBIO | K1107 | |
| 磷酸酶抑制剂 | APEXBIO | K1015 | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| Kv1.3抗体 | Almone | APC-101 | |
| Pan Kla抗体 | PTM BIO | PTM-1401 | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | SA00001-2 | |
| ECL底物 | BIO-RAD | 1705060 | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | BIO-RAD | 1708265 | |
| 分离模块 | Protein Simple | SM-W001 | |
| Aβ抗体 | Biolegend | 803014 | |
| TSG101抗体 | Proteintech | 8283-1-AP | |
| β-actin抗体 | Abcam | 8227 | |
| 抗兔检测模块 | Protein Simple | DM-001 | |
| 抗鼠检测模块 | Protein Simple | DM-002 | |
| 免疫染色 | Iba1抗体 | Wako | 019-19741 |
| Iba1抗体 | Novus | NB100-1028 | |
| Kv1.3抗体 | Santa | sc-398855 | |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| 驴抗山羊488荧光二抗 | Jackson | 705-545-147 | |
| 驴抗兔488荧光二抗 | Jackson | 711-545-152 | |
| 驴抗小鼠555荧光二抗 | Bioss | bs-0295D-BF555 | |
| DAPI染色液 | Solarbio | C0065 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Solarbio | S2100 | |
| 硫黄素S | Sigma | T1892 | |
| LysoTracker溶酶体探针 | Beyotime | C1046 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 学习无助模型 | 小鼠品系、年龄、电击强度、电击次数、电击间隔 阅读提示：Methods: Learned helplessness behavior experiment |
| 行为学测试 | Y迷宫测试条件、MWM参数（水温、平台位置、训练天数、试验次数） 阅读提示：Methods: Morris water maze test, Y maze test |
| 微胶质分离和乳酸测量 | 分离试剂盒、乳酸测定方法、归一化方式 阅读提示：Methods: Adult microglia isolation and measurements of lactate |
| 原代微胶质培养与处理 | 细胞来源、培养时间、乳酸浓度、处理时间 阅读提示：Methods: Primary microglia culture, Aβ1-42 Preparation and treatment |
| 电生理记录 | 记录模式、电极内液成分、电压方案、乳酸孵育时间 阅读提示：Methods: Electrophysiology |
| 外泌体分离与表征 | 离心速度、时间、NTA参数、Western blot方法 阅读提示：Methods: Isolation of exosomes, Nanoparticle tracking analysis, Western blot |