“一招鲜”：冷冻+石蜡切片，轻松构建肿瘤脱细胞支架新方法！

    众所周知，肿瘤的发展是肿瘤细胞与其微环境相互作用的动态过程，在个体化精准医疗的发展背景下，进一步完善肿瘤进展和转移的分子机制，有助于深入地了解其生物学行为，也为肿瘤患者的治疗寻找新的契机。

       近些年来，组织工程技术构建的肿瘤模型成为肿瘤生物学诊断和恶性肿瘤治疗研究的热点。其中组织或者器官脱细胞后剩余的结构和功能蛋白质复合体（即脱细胞支架）成为组织工程中最有前途的新型生物材料之一；脱细胞技术可以有效保留自然组织细胞外基质，无免疫原性，清除组织或器官中特定的同种/异种细胞，具有良好的生物相容性和机械性能；脱细胞支架可以用合适的细胞再生细胞，创建适合于组织、器官移植的组织工程化移植物；理想支架可模仿人类组织的自然结构，为肿瘤细胞黏附、增殖、分化、侵袭和迁移提供合适的环境。

       目前脱细胞支架已经在全器官工程中器官再生、生物打印、组织修复和重建、疾病模型和药物筛选以及细胞培养等方面有广泛应用。随着再生医学的发展和新兴技术的兴起，脱细胞、再生的方法及药物递送的技术更新，脱细胞支架将能实现其在组织工程和生物医学领域的应用，在临床诊断和治疗上发挥更大的价值。

背景：

       细胞外基质(extracellular matrix, ECM)是一种由细胞分泌到胞外间质构成3D复杂网架结构的大分子物质，主要作用是支持和连接组织的结构及调节细胞的生理活动，其主要成分聚糖和纤连蛋白构成结构支架。组织经过复杂的脱细胞过程可获得天然的ECM支架，常用于组织工程学与再生医学的器官重建。作为肿瘤微环境的重要组成部分，目前ECM成为研究热点，但有关肿瘤ECM的制备鲜有报道，主要原因是样本量少、制作难度大。目前，组织脱细胞方法有物理、化学和酶解等方法。

       本文介绍运用Epredia Cryostar NX70冷冻切片机联合石蜡切片，使用化学方法制作脱细胞支架材料的简单方法，效果较好，现简单报道如下：

方法：

一、冷冻切片

       将人肝肿瘤（含癌旁）组织切成大小1.5cmX1.5cmX1.0cm块状，冷冻托盘涂抹少量OCT包埋剂后将组织黏合、冷冻；设置冷冻切片机温度（样本头温度-5℃，刀架度-25℃，切片厚400μｍ），进行冷冻切片（图1），依次将切好样本放入６孔板内（图2），直至组织切完。在培养皿内依次加入0.1% Triton X-100工作液摇床震3h(80r/min)、去离子水摇床震荡3h、 0.1% SDS工作液摇床震荡6h、去离子水摇床震荡3h、0.1% Triton X-100工作液摇床震荡3h、去离子水摇床震荡3h、PBS摇床震荡3h。

二、石蜡包埋和切片

       选取1片脱细胞组织（图3）放入垫硬纸板的包埋盒中，展平、加盖，放入10％中性福尔马林固定48h，将样本放入全自动脱水机中进行脱水、透明、浸蜡处理；石蜡包埋后（图4）、石蜡切片机切片厚度为4μｍ，贴于黏附载玻片上备用。

• 图1：人肝肿瘤（含癌旁）组织行冷冻切片，切片厚400μｍ；
• 图２：将切好的样本放入６孔板内，进行脱细胞化处理；
• 图３：脱细胞后的细胞外基质支架材料呈白色透明状；
• 图４：细胞外基质支架材料经固定、脱水、透明、浸蜡后进行石蜡包埋

三、常规HE、天狼星红染色、免疫组化和免疫荧光染色 　

1. HE染色：脱蜡后将切片放入苏木精染液3min，1%盐酸乙醇分化，流水返蓝，伊红染色30s，常规脱水透明、Clearvue封片机封片；
2. 天狼星红染色：切片脱蜡后滴加天狼星红染液，常温放置30min，蒸馏水稍洗，常规脱水透明、封片；
3. 免疫组化染色（采用EnVision两步法）：切片脱蜡后放入柠檬酸组织抗原修复液中，95℃水浴20min，冷却后PBS清洗，0.3% H2O2孵育15min阻断过氧化物酶，混合血清室温封闭20min，甩掉后直接在组织上滴加一抗Fibronectin（稀释比1:100）工作液，4℃冰箱孵育过夜后PBS清洗，滴加兔/鼠通用型二抗，37℃孵育45min，清洗后滴加DAB工作液显色；
4. 免疫荧光染色：柠檬酸水浴抗原修复，过氧化物酶阻断，血清封闭后滴加一抗Collagen I（稀释比1:200）工作液，4℃冰箱孵育过夜后PBS清洗，避光滴加二抗驴抗兔IgG（Alex Fluor @594，稀释比1:500）， 37℃孵育45min，清洗后滴加DAPI 5min，清洗3次后缓冲甘油封片。

结果：

1. 人肝肿瘤组织经脱细胞化处理后，HE染色中细胞核无苏木精着色，间质呈红色（图5）；
2. 天狼星红染色可见大量胶原纤维成分，呈亮红色（图6）；
3. 免疫组化Fibronectin抗体验证大量纤连蛋白的存在，呈棕黄色网状分布（图7）；
4. 免疫荧光Collagen I抗体呈红色丝状广泛分布（图8）;
5. 脱细胞处理前人肝脏组织（对照组）经DAPI染色，细胞核呈蓝色球状分布（图9）；
6. 脱细胞后经DAPI染色已无蓝色细胞核存在（图10）。

人肝肿瘤组织脱细胞后的细胞外基质支架材料 

• 图５：HE染色示间质呈红色，无细胞核着色；
• 图６：天狼星红染色可见大量胶原纤维成分，呈亮红色；
• 图７：免疫组化Fibronectin抗体染色，纤连蛋白呈棕黄色网状分布；
• 图８：免疫荧光Collagen I抗体染色，I型胶原呈红色分布；
• 图９：未脱细胞处理的人肝肿瘤（对照组）DAPI染色，细胞核呈蓝色球状分布；
• 图10：人肝肿瘤脱细胞后的细胞外基质支架材料DAPI染色，已无细胞核

      本组实验结果显示，新鲜组织冷冻后切成厚薄均一的片状，经脱细胞处理联合使用石蜡包埋切片的方法，最终采用多种病理染色方法验证，脱细胞支架结构保持完整且染色效果良好。

 

参考文献：

陈菲, 李丽, 包春娟: 一种运用病理切片技术制作脱细胞支架的简易方法介绍. 临床与实验病理学志 2024, 40(2):216-218.

 

 

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